负载柚皮素/维生素K2的三明治网格状纳米纤维膜的构建及其对骨再生影响的研究

作     者：王佳峰 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘宏伟

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 10[医学] 

主      题：高压静电纺丝 柚皮素 维生素K2 纳米纤维 骨再生修复 

摘      要：目的:1、构建负载柚皮素/维生素K并具有三明治结构网格状的纳米纤维支架并评价不同材料支架组的理化性质及其生物相容性。2、将各组纤维支架与BMSCs共培养,评价各组支架的促成骨能力。3、在RAW264.7培养过程中加入RANKL诱导因子,使RAW264.7细胞往破骨细胞方向转化,同时将各组纤维支架与RAW264.7共培养,探讨不同纤维支架组调节破骨细胞生长的能力。4、构建大鼠颅骨骨缺损模型,将各组纤维支架植入大鼠体内,评价各组纤维支架对大鼠骨缺损修复能力的评价及调节破骨细胞生长的能力。方法:1、将柚皮素和维生素K分别掺入到12%聚已内酯（PCL）溶液中和10%聚已内酯（PCL）+10%明胶（G）溶液中混匀。采用高压静电纺丝技术,在收集装置上覆盖一层铜网,然后将上述两种复合溶液分批次喷涂到铜网上。可成功构建具有三明治结构网格形状的纤维支架膜。PG组:不掺入药物组;PG-N组:掺入柚皮素组;PG-V组掺入维生素K组;PG-NV组同时掺入柚皮素和维生素K组。2、通过光学显微镜,扫描电镜（SEM）观察成功构建后的纤维支架膜的微观形态及结构。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术检测各组纤维支架基团组成。同时采用水接触角测定、透气性测定、吸水性测试、孔隙率检测、体外药物缓释、体外降解测定、力学性能检测等方法对各组支架的理化性质作出评价。3、通过活死染色、鬼笔环肽染色、细胞黏附、CCK-8实验检测各组支架的生物相容性及促进细胞增殖能力。4、各组支架与BMSCs共培养3天、7天采用实时荧光PCR检测成骨相关基因（RUNX-2,OSX,ALP,COL-1,OCN,OPN）的表达水平,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Western blotting、免疫荧光等实验方法评价不同材料的体外促成骨能力。5、采用RANKL诱导因子将小鼠源性巨噬细胞系RAW264.7往破骨细胞方向转化,并通过检测RAW264.7诱导前后破骨相关基因（RANKL,Cathespin K）表达水平的变化及鬼笔环肽染色观察细胞形态的改变判断是否成功诱导破骨细胞（OC）。将不同材料组与加入RANKL诱导因子生物的RAW264.7共培养5天,分别采用RT-PCR检测各组材料破骨相关基因的表达情况,Western blotting实验、免疫荧光实验、TRAP染色实验评价不同材料对破骨细胞生长的调节作用。6、将各组支架植入大鼠颅骨骨缺损处,术后4周8周后取材,采用Micro-CT,三色Masson染色、HE染色和免疫组织化学染色分别评价不同材料在大鼠体内的骨再生修复能力及生物相容性。采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色评价不同材料对缺损处破骨细胞生长调节的影响。结果:1、构建的纤维支架呈白色,质地韧且软,厚度约0.6～0.8 mm,各组材料宏观结构无明显差异。扫描电镜观察显示,各组纤维材料均具有三明治结构和网格形状,纳米纤维在网格中央分布相对稀疏,在网格边上分布相对密集,拥有良好的孔隙率。柚皮素和维生素K的掺入材料的亲水性,吸水膨胀性,透气性,孔隙率,体外降解率,力学性能等理化性质都无明显影响（P0.05）。体外药物缓释实验显示柚皮素和维生素K2能成功的从支架中释放出来,且纤维材料对药物的释放具有缓释作用,能持续释放7天左右。2、生物相容性实验结果证明,各组纤维支架未显示出明显的细胞毒性,具有促进细胞黏附及生长功能。活死细胞染色实验可看出支架与BMSCs共培养3天,大量的细胞存活并增殖迅速,死亡的细胞极少。细胞黏附实验,在扫描电镜下显示,大量的细胞黏附在各组支架上,细胞伸出大量伪足,均匀铺展,形态结构良好。细胞增殖实验,通过CCK-8试剂检测支架与细胞培养1、3、7天的生长增殖情况,得出各组细胞均具有良好的增殖速率,且各组之间无明显差异（P0.05）。3、各组之间的体外成骨诱导性评价表明PG-NV组支架具有促进BMSCs往成骨细胞方向分化的作用,对骨缺损修复具有积极影响。通过RT-PCR实验,得出掺入柚皮素和维生素K的纤维支架明显促进了成骨相关基因的表达（P0.01）。免疫印迹实验和免疫荧光实验的结果表明PG-NV组支架可以促进成骨相关因子的分泌。碱性磷酸酶活性和钙结节矿化沉积PG-NV组相较于其他组有明显的增加。4、RANKL诱导因子诱导RAW264.7细胞向破骨细胞方向转化,通过RT-PCR检测,诱导后的RAW264.7细胞破骨相关基因表达水平成倍上调（P0.001）。鬼笔环肽染色图像显示诱导后细胞形态有明显的改变,从体积小而圆的单核细胞转化为体积大,形态不规则的多核细胞。将各组支架与RAW264.7细胞共培养同时加入RANKL诱导因子评价不同纤维支架组对破骨细胞生长调节的影响,RT-PCR结果显示,PG-NV+RANKL组的破骨相关基因表达水平相较于NC+RANKL组,