BCAT2调控的肠上皮细胞铁死亡影响克罗恩病肠道屏障功能的作用研究

作     者：叶严珏 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尹俐

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：克罗恩病 铁死亡 BCAT2 屏障功能 

摘      要：克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种原因不明的慢性炎症性肠道疾病,其发病率在全世界范围内呈上升趋势。肠道屏障损伤是CD的一个重要特征,会引起紧密连接蛋白结构和功能的紊乱,导致肠上皮通透性增加,进一步加剧肠道炎症反应。因此,探究CD肠道屏障功能障碍机制,将会为CD治疗提供新思路。 铁死亡是由铁依赖性脂质过氧化引起的一种细胞死亡形式。研究发现,肠内过量的铁积累能引起脂质过氧化而使得肠上皮细胞发生铁死亡,破坏肠黏膜机械屏障,导致炎症性肠病的发生。支链氨基酸转氨酶2(Branched chain amino acid transaminase 2,BCAT2)是支链氨基酸分解代谢第一步所需的线粒体同工酶,调控谷氨酸的代谢。在胰腺癌及肝癌等疾病中,BCAT2可通过调节细胞内谷氨酸水平抑制肿瘤细胞铁死亡的发生。然而,目前尚未有报道表明BCAT2是否可以通过调控肠上皮细胞铁死亡来改善CD肠黏膜屏障功能障碍,需要进一步的研究来证实这一假设。 本课题前期通过生物信息学分析发现,CD患者中BCAT2与铁死亡特征分子表达高度相关,且相较于健康人群,CD患者肠组织中BCAT2表达水平显著减少。这些结果提示CD发生铁死亡并伴随BCAT2变化。为了证实这一推测,本研究通过构建CD细胞模型,并使用铁死亡诱导剂Erastin处理NCM460细胞和Caco2细胞诱导肠上皮细胞铁死亡作为阳性对照组。结果发现,与对照组相比,LPS组细胞中铁死亡特征分子蛋白水平变化显著,趋势与阳性对照组一致,这表明LPS可诱导NCM460细胞和Caco2细胞发生铁死亡。进一步检测发现,LPS处理后NCM460细胞和Caco2细胞中BCAT2 m RNA和蛋白水平显著降低,且CD患者肠组织中BCAT2的m RNA和蛋白水平也显著减少。这些结果证实CD发生铁死亡并伴随BCAT2表达减少。为了阐明BCAT2在肠上皮细胞铁死亡中的作用,本研究基于构建的BCAT2过表达细胞模型,给予LPS处理后检测谷氨酸、MDA、谷胱甘肽以及铁死亡特征分子的表达水平。结果表明,过表达BCAT2可逆转肠上皮细胞铁死亡特征分子表达水平的改变,降低MDA水平,提高谷氨酸水平并增加还原性谷胱甘肽水平。为了进一步探究BCAT2对肠上皮细胞屏障功能的影响,我们检测了紧密连接蛋白水平、跨内皮电阻以及荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖渗透率,发现过表达BCAT2可部分逆转LPS引起的紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin蛋白水平下降、Caco2细胞电阻值降低和细胞通透性增加。这些结果表明,BCAT2可通过抑制铁死亡改善LPS引起的肠上皮细胞屏障功能紊乱。 在体内实验中,本研究通过2,4,6-三硝基苯磺基酸(2,4,6-trinitroBenzenesulfonicacid,TNBS)构建小鼠CD动物模型。实验结果显示,TNBS组小鼠结肠长度明显缩短,小鼠体重下降。H&E染色结果显示,TNBS组小鼠结肠组织有明显病变,包括免疫细胞浸润,肠粘膜损伤。进一步研究发现,TNBS组小鼠结肠组织中铁死亡特征分子和紧密连接蛋白表达变化显著,且BCAT2的m RNA和蛋白水平减少。这些结果表明CD小鼠中发生铁死亡和屏障功能障碍并伴随BCAT2表达水平减少。这些结果与我们的体外实验结果一致,进一步证实了我们的推测。本研究通过体内外实验证明,BCAT2通过抑制肠上皮细胞铁死亡可减轻CD肠道屏障功能障碍。本研究为CD的防治提供了新的思路和靶点。