力学异质性肝纤维化仿生平台的制备及其对肝星状细胞的调控及机制研究

作     者：尹诗韵 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈国宝

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肝纤维化 肝星状细胞 肝纤维化仿生平台 脱细胞肝基质 光交联 

摘      要：肝纤维化是致病因子导致肝脏损伤,肝脏结缔组织异常增生而引起的一种病变。肝纤维化的标志就是肝结构的破坏和异常细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的沉积。肌成纤维细胞（myofibroblasts,MFs）是纤维化过程中产生过量ECM、促进基质沉积导致肝基质刚度上升的主要效应细胞。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是肝内MFs的主要细胞来源之一,所以HSCs的激活是肝纤维化中的一个重要的事件。然而,由基质刚度介导的肝纤维化具体发生机制尚不明确。因此,迫切需要在体外构建能够真实模拟体内肝纤维化发生和发展中的基质微环境的研究平台,以此研究不同基质刚度对HSCs和MFs的生物行为影响。不同纤维化程度的肝基质中同一区域内力学存在不均匀的情况,即为力学异质性。然而,目前大多数研究中所采用的培养基质都是刚度均匀的,忽略了对肝纤维化中力学异质性的研究。本研究使用天然不同肝纤维化程度的脱细胞肝基质（decellularized liver extracellular matrix,DLM）和甲基丙烯酸透明质酸（methacrylated hyaluronicacid,Me HA）,构建了力学异质性的肝纤维化仿生平台。该仿生平台三个区域的基质刚度分别对应着正常肝脏、早期和晚期纤维化肝脏组织的刚度。将HSCs分别与单一的凝胶和异质性凝胶共培养,探究凝胶对HSCs的增殖、迁移和活化等行为的调控影响,并进一步探究在这一过程中HSCs内部的信号转导机制。具体的研究内容和结果如下: （1）通过对大鼠进行注射CCl方式建立肝纤维化模型和冻融循环、Triton X-100/氨水和Dnase I联合脱细胞的方法可以获得不同纤维化程度的DLM。DLM中细胞被成功去除并保留的ECM成分。此外,纤维化程度越重的DLM凝胶,其内部的纤维直径和力学性能更大。这可为后续制备不同基质刚度纤维化仿生凝胶提供理论基础。 （2）将DLM凝胶与Me HA相结合,制备了三组不同刚度的纤维化仿生凝胶,它们力学分别对应着正常肝脏、早期和晚期纤维化肝脏的刚度,为2.18±1.11 k Pa、6.89±1.64 k Pa和20.42±6.44 k Pa。当刚度越大时,该凝胶内部孔隙越来越多,但孔径和孔隙率越来越小,这说明其交联的密度更大。由于三组凝胶的高交联密度,因此它拥有稳定的形态,不易降解。在极强亲水性的Me HA的作用下,三组凝胶拥有较高的保水性。这有助于为培养的细胞提供丰富的营养物质和粘附,有利于后续细胞实验的开展。 （3）将HSCs与三组凝胶共培养7天后,证实了该凝胶具有良好的细胞相容性。此外,我们发现凝胶中ECM成分和高刚度能够对HSCs增殖能力、迁移潜能和活化起到促进的作用。在ECM成分和高刚度的共同作用下,Piezo1-YAP信号通路表达上调。这可能是导致HSCs行为发生的关键机制,提示了Piezo1与YAP可能为肝纤维化疾病潜在的治疗靶点。 （4）联合蜂窝状模具和光交联技术将三组凝胶制备成一体式的力学异质性平台。与独立的凝胶调控HSCs行为的结果相比,力学异质性凝胶中各区域除了会调控本区域中的HSCs的行为之外,还会相互调控彼此区域上的细胞的行为。除此之外,与独立的凝胶的调控结果相比,该力学异质性平台的高刚度与中刚度区域中细胞的增殖和活化明显下降。这说明了在力学异质性环境下HSCs的活化可以被负向调节。 综上所述,本研究采用分离和一体式的纤维化仿生平台研究了刚度与生化成分对HSCs的行为调控,发现了更高的刚度和纤维化病程更重的生化信号能显著促进HSCs的增殖、迁移潜能、活化和Piezo1-YAP信号通路的导通。此外,与单一凝胶相比,在力学异质性环境下的HSCs的活化可以被负向调节。这些结论将为研究人员了解肝纤维化的病理机制和潜在的治疗靶点提供新的见解。