下调LncRNA MIAT对小鼠脑缺血再灌注损伤影响机制的研究

作     者：卢虹宇 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦超

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：缺血性脑卒中 LncRNA MIAT TDP-43 凋亡 

摘      要：目的和意义:通过体内短暂性大脑中动脉闭塞模型模拟脑缺血再灌注损伤,探索下调LncRNA MIAT对脑缺血再灌损伤的影响及与TDP-43蛋白的作用机制。方法:(1)数据库预测与MIAT相互作用的RBPs,通过RIP-qPCR实验证明LncRNA MIAT与TDP-43蛋白的结合关系。(2)随机选取28只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠设立4个组(Sham组、MCAO/R组、MCAO/R+sh-NC组、MCAO/R+sh-MIAT组),每组小鼠数量为7只。(3)对MCAO/R组、MCAO/R+sh-NC组和MCAO/R+sh-MIAT组的小鼠用改良线栓法在脑血流仪的检测下建立MCAO/R模型,模拟体内脑缺血再灌注损伤。(4)Western blotting和免疫荧光共标记分别观察脑缺血再灌注后TDP-43蛋白的表达和神经元中亚细胞定位的变化。(5)通过FISH实验观察LncRNA MIAT在SH-SY5Y细胞内的定位情况。(6)通过尾静脉注射腺相关病毒(AAV)沉默MCAO/R+sh-MIAT组小鼠体内的LncRNA MIAT,然后用RT-qPCR检测其沉默效果。(7)使用m NSS评分法和行为学试验分别评估LncRNA MIAT沉默后的MCAO/R建模小鼠的神经功能缺损程度和运动神经功能。(8)通过Nissl染色观察沉默LncRNA MIAT后脑缺血再灌注引起脑神经元丢失的情况和损伤程度。(9)Western blot检测沉默LncRNA MIAT的小鼠脑缺血再灌注后TDP-43的表达变化及凋亡相关蛋白的改变。结果:(1) RNAInter数据库预测MIAT可能与TADBP相互作用,之后用RIP-qPCR实验证明LncRNA MIAT在SH-SY5Y细胞中能与TDP-43特异性结合。(2)LncRNA MIAT探针的荧光大部分集中在细胞质中,表明MIAT主要在SH-SY5Y细胞质中表达。(3)用WB检测小鼠MCAO/R建模后TDP-43、TDP-35蛋白表达增加和25KDa片段裂解生成,RT-qPCR检测脑组织缺血半暗带皮质区MIAT表达增加。(4)在正常生理情况下TDP-43免疫荧光主要在神经细胞核内分布,小鼠MCAO/R建模后脑内神经元胞核和胞质中均能观察到TDP-43荧光,TDP-4在胞核和胞质中均有分布。(5)小鼠尾静脉注射AAV 3周后,免疫荧光法观察AAV在脑神经元内的转染情况,AAV能够成功通过血脑屏障并转染进小鼠脑内神经元并通过RT-qPCR检测发现AAV-sh-MIAT能有效抑制小鼠脑神经元内MIAT的表达,同时也能降低MCAO/R引起的MIAT增高趋势。(6)Nissl染色观察MCAO/R术后小鼠脑缺血再灌注区神经细胞尼氏体显著减少甚至消失;而沉默LncRNA MIAT后脑缺血区域的尼氏体丢失减少。(7)体内沉默LncRNA MIAT后对MCAO/R建模小鼠m NSS神经功能缺损评分,下调LncRNA MIAT可以降低小鼠神经功能缺损评分。(8)小鼠MCAO/R术后导致其平衡能力和运动协调能力障碍和肌力下降,而沉默LncRNA MIAT后可减轻平衡能力和运动协调能力障碍,肌力增加。(9)小鼠MCAO/R后凋亡相关caspase 3 m RNA和蛋白表达增高,Bcl-2表达m RNA和蛋白明显降低。但沉默LncRNA MIAT后表达下降caspase 3 m RNA和蛋白表达增高,Bcl-2 m RNA和蛋白表达升高。(10)沉默LncRNA MIAT后,MCAO/R建模的小鼠全长TDP-43蛋白水平无明显降低,而35-KDa和25-KDa裂解片段则显著降低。结论:在急性缺血性脑梗死中,脑缺血半暗带皮质区全长TDP-43和35-KDa、25-KDa裂解片段水平增高,促进细胞凋亡。抑制LncRNA MIAT的表达可以通过降低TDP-43蛋白的裂解片段表达,抑制神经细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤,缓解神经功能障碍。