p75NTR介导CRS诱导的抑郁样行为及其机制研究

作     者：彭禹源 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：鲁秀敏

授予年度：2024年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：抑郁症 p75NTR 海马神经元 凋亡 自噬 突触可塑性 

摘      要：抑郁症(Depression)是一种常见的精神障碍,主要临床特征是显著且持续的情绪低落、认知障碍、躯体化症状(胸闷、气促),甚至有自杀倾向。近年来抑郁症研究备受关注,但发病机制尚不明确,缺少有效治疗靶点。p75神经营养素受体(p75neurotrophinreceptor,p75NTR)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,参与了神经元的存活和死亡,在重度抑郁症患者的血清和淋巴细胞中表达均上调。推测,p75NTR参与抑郁症的发生发展,但其具体作用机制仍不清楚。 本研究以p75NTR为靶基因,分别以靶向敲除(Knockout,KO)外显子Ⅲ的p75NTR基因纯合敲除小鼠和腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)介导的p75NTR过表达小鼠为研究对象。采用慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)法建立抑郁小鼠动物模型,应用抑郁症研究中经典的行为学实验(糖水偏好实验、旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验)评估p75NTR基因敲除和p75NTR基因过表达对抑郁小鼠自发探索能力、运动水平和抑郁样行为的影响。进一步在组织水平观察抑郁小鼠海马DG区的病理变化,并通过免疫荧光和蛋白免疫印迹技术初步探讨其可能的分子机制,为抑郁症的药物研发和临床治疗提供参考。 主要研究内容: 1.p75NTR基因敲除/过表达小鼠的获得与鉴定 (1)将生长至性成熟期的p75NTR杂合子小鼠进行雌雄配对,繁育p75NTR基因敲除(Knock out,KO)小鼠和野生型(Wild type,WT)小鼠,并通过PCR法和蛋白免疫印迹法定性鉴定和验证小鼠基因型。 (2)将C57/BL6J雄性小鼠通过侧脑室注射AAV-SYN-NGFR-HA和AAV-SYNMCS-3FLAG病毒,建立p75NTR过表达(Overexpression,OE)小鼠和空载病毒(Blank vehicle,BV)小鼠模型,并通过免疫荧光或蛋白免疫印迹法检测p75NTR和HA-tag蛋白的表达,以鉴定过表达小鼠。 2.抑郁动物模型制备与实验分组 慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)法制备抑郁小鼠动物模型:用小鼠固定器将小鼠囚禁,置于安静的暗室中禁锢2 h,持续14天。 (1)p75NTR基因敲除组:将48只8-10周龄健康C57/BL6J雄性小鼠分为WT小鼠和KO小鼠。随后,将WT和KO小鼠进一步随机分为造模和不造模2个亚组,共4组,每组12只:(1)WT组;(2)WT+CRS组;(3)KO组;(4)KO+CRS组。 (2)p75NTR基因过表达组:将64只8-10周龄健康C57/BL6J雄性小鼠,随机分为4组,每组16只:(1)WT组;(2)OE+CRS组;(3)BV+CRS组;(4)WT+CRS组。 3.p75NTR基因敲除/过表达对抑郁小鼠行为学的影响 为评估p75NTR在抑郁小鼠自发探索和抑郁样行为中的作用,我们通过糖水偏好实验评估小鼠快感缺失症状,旷场实验观察小鼠在陌生环境下的自发探索行为和紧张度,悬尾实验和强迫游泳实验评估小鼠在绝望状态下的求生意志,进一步评价小鼠的抑郁样行为。 4.p75NTR基因敲除/过表达对抑郁小鼠海马组织病理学的影响 为评估p75NTR对抑郁小鼠海马区组织形态学改变的影响,我们通过HE染色检测小鼠海马病理组织形态学变化,Nissl染色观察海马DG区神经元尼氏体的改变情况,统计海马神经元损伤数量。 5.p75NTR基因敲除/过表达对抑郁小鼠海马神经元自噬的影响及机制 为评估p75NTR对抑郁小鼠海马神经元自噬的影响与机制,采用蛋白免疫印迹法检测各组小鼠海马区Beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白的表达变化。 6.p75NTR基因敲除/过表达对抑郁小鼠海马神经元凋亡的影响 为评估p75NTR对抑郁小鼠海马神经元凋亡的影响,采用免疫荧光或蛋白免疫印迹法检测各组小鼠海马区Bcl-2、Bax及Neu N蛋白的表达变化。 7.p75NTR基因敲除/过表达对抑郁小鼠海马神经元突触可塑性的影响 为评估p75NTR对抑郁小鼠海马神经元突触可塑性的影响,我们使用高尔基染色检测海马神经元树突形态和数量及树突棘的密度,并且采用免疫荧光或蛋白免疫印迹法检测各组小鼠海马区PSD95和SYN1蛋白的表达变化。 主要实验结果: 1.成功繁育并鉴定了p75NTR基因敲除小鼠;成功建立了p75NTR过表达小鼠和空载病毒小鼠模型。 2.采用CRS法成功建立了抑郁小鼠动物模型。 3.行为学实验结果表明,p75NTR基因敲除/过表达可以减轻CRS诱导的抑郁小鼠的抑郁样行为。 4.病理实验结果表明,p75NTR基因敲除/过表达可以缓解CRS诱导的抑郁