荔枝果皮BPOD的纯化、鉴定及表儿茶素的酶促氧化分析

作     者：孙冷雪 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭志雄;潘东明

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：荔枝果皮 POD和PPO 纯化与鉴定 EC 酶促氧化 

摘      要：以成熟的‘乌叶’荔枝果实为材料,对果皮中结合态POD（BPOD）的主要组分进行了分离纯化,对其主要酶学性质进行了研究;应用串联质谱技术对纯化得到的BPOD各组分分别进行了部分肽段的氨基酸序列解析,根据质谱结果克隆获得了编码BPOD组分的cDNA;分离纯化得到荔枝果皮的PPO,应用串联质谱技术鉴定了其归属,并对其主要生化性质进行了研究;应用HPLC-DADESIMS-MS技术,分析了可溶性POD（SPOD）、BPOD和PPO催化（-）-表儿茶素（EC）的氧化产物。主要研究结果如下:1.荔枝果皮BPOD的分离纯化与酶学特性研究通过反复抽提、离心,去除荔枝果皮的SPOD,以100mmol/LTris-HCl（pH8.0）,3.0mol/LNaCl,20%甘油,0.1%Triton X-100 缓冲液提取制得 BPOD 粗酶液。经过 Streamline Phenyl、CM-52、Phenyl sepharose HP和Superdex 200等柱层析,纯化得到BPOD最主要的2个组分,分别命名为BPOD-2和BPOD-3。SDS-PAGE结果显示,BPOD-2和BPOD-3的表观分子量均约为35kD。对BPOD-2和BPOD-3的主要酶学性质进行了研究。BPOD-2和BPOD-3的最适反应pH均为6.0,最适反应温度分别为40℃和45℃。BPOD-2与BPOD-3的底物特异性相似,两者对间苯二酚、藜芦醇、苯甲醇均未显示活性,对其他底物的活性强弱顺序为:愈创木酚4-甲基邻苯二酚焦性没食子酸邻苯二酚没食子酸绿原酸4-甲氧基酚对苯二酚。金属盐离子对BPOD-2和BPOD-3的活性影响微弱;去垢剂中,CTAB对两组分的活性有较大的抑制作用,Triton X-100对BPOD活性的效应十分微弱,螯合剂EDTA对其活性影响弱;L-半胱氨酸强烈抑制两组分的活性,DTT和ASA几乎完全抑制两组分的活性。BPOD-2和BPOD-3对愈创木酚的Km值分别为2.97和2.58,二者十分接近;对H2O2的Km值分别为9.48和26.07,表明两组分对于愈创木酚具有很强的亲和性。***-2与BPOD-3的质谱鉴定与cDNA克隆对纯化得到的BPOD两组分进行胶内胰蛋白酶消化和MALDI-TOF MS/MS质谱分析,发现BPOD-2和BPOD-3的高丰度肽段具有很高的相似性,其中,序列为TASLSAANSDLPSPFADLATLIAR的肽段为两者所共有;同时两组分的肽段也具有一定的差异性。Mascot检索结果显示,BPOD-2与BPOD-3均与gi|696949335相匹配,表明其均为同一个cDNA编码,因翻译后修饰差异而形成同工酶。克隆得到编码BPOD-2与BPOD-3的ORF,大小为960bp,编码319个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为34.98KD,预测pI为8.06。3.荔枝果皮PPO的纯化、质谱鉴定与酶学特性研究通过 Streamline Phenyl、DEAE-52、Phenyl sepharose HP 和Sephacryl S-200柱层析,从荔枝果皮纯化得到单一组分的PPO,命名为LPO;MALDI-TOF测定其精确分子量为96.565 kD。研究发现,LPO为蓝色蛋白,光谱扫描的结果显示其在300～320nm具一明显的肩峰,在600nm附近具显著的吸收;石墨炉原子吸收法测得每个蛋白分子含4个Cu。应用LC-MS/MS串联质谱解析了 LPO的2个胰酶水解肽段的氨基酸序列,分别是:APPAYMPSCSSS、NPWSDGPEYVTQCK。Mascot检索结果显示,LPO显著匹配于荔枝漆酶（GenBank:ACB22018.2）。以（-）-EC为底物,LPO最适反应pH为7.5,温度对其活性的影响小。测试发现,LPO对酚类底物表现出很高的特异性。其对（-）-EC的反应活性大,对ECG、ECG、儿茶素、邻苯二酚等只具微弱的活性,对其余底物则未显示活性:说明,LPO为高度特异的（-）-EC氧化酶。金属离子对LPO的抑制作用十分微弱,去垢剂Triton X-100、SDS和螯合剂EDTA对其活性均无较大影响,H2O2抑制酶的活性（终浓度为1.0mM时酶活仅剩50%）,CTAB强烈抑制酶的活性,L-半胱氨酸几乎完全抑制其活性。***以及PPO对（-）-EC的氧化产物分析对SPOD A1、BPOD-2和PPO催化EC反应特性进行了比较。LPO对EC的Km值最小,显示对EC更强的底物亲和性;而BPOD-2的Vmax远大于SPOD-A1和LPO,表明BPOD-2对其具极高的催化效率。应用HPLC-DAD ESI-MS/MS技术对EC的酶促氧化产物进行了分析。负离子模式下的全离子扫描获得了 m/z为289.2、577.2、575.2、863.