广义虾脊兰属（Calanthe s. l.）植物物种鉴定体系的初步构建

作     者：黄元贞 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：翟俊文

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：广义虾脊兰属 形态学 流式细胞 DNA条形码 物种鉴定 

摘      要：广义虾脊兰属（Calanthe s.l.）是兰科（Orchidaceae）植物中极具观赏价值和药用价值的一个属,包括虾脊兰属（Calanthe）、鹤顶兰属（Phaius）、拟鹤顶兰属（Paraphaius）、黄兰属（Cephalantheropsis）、落苞兰属（Styloglossum）和离翅兰属（Preptanthe）。全属约250～300种,中国约有60种,其中超过20种为特有种,主要分布于西南地区和长江流域以南地区。前人在分类学方面做了许多工作,但因其形态变异大、过渡类型多,物种鉴定一直存在争议,也是兰科植物鉴定的疑难类群之一。本研究利用形态学、细胞学和DNA条形码等手段,初步构建该属植物的鉴定体系,旨在解决广义虾脊兰属植物鉴定难题,为该类群后续研究和利用奠定基础。主要研究结果如下:（1）形态学研究采用DUS测试方法测量广义虾脊兰属形态特征,根据主成分分析、数量分析、R型分析结果对127个测试性状进行处理,最终筛选出84个信息丰富的性状并做Q型聚类。结果发现:距的有无和长短、唇瓣是否分裂、是否有附属物等特征是鉴定广义虾脊兰属植物的重要形态学依据;当欧式距离L1=5时,可将31个品种划分为4个类群;DUS测试方法可以有效地借鉴到该类群的分类鉴定。（2）细胞学研究用已知为二倍体的铁皮石斛（Dendrobium officinale）为对照,利用流式细胞术对广义虾脊兰属植物的倍性进行分析,确定镰萼虾脊兰（***）、密花虾脊兰（***）、毛虾脊兰（***）这3种虾脊兰属植物为三倍体,其余检测样品均为二倍体。广义虾脊兰属植物基因组大小研究显示,二倍体之间基因组大小差异小,随着倍性增加基因组增大,差异显著性增大。总体来说,细胞学特征对广义虾脊兰属植物的鉴定意义不大。在该研究过程中,优化了细胞核悬浮液制备方法,摸索出一套快速且高效、经济的广义虾脊兰属流式细胞术流程,证明了改良版Galbraith’s最适合广义虾脊兰属植物流式细胞实验。其配方如下:45mmol·L MgCl,30 mmol·L Sodium Citrate,20 mmol·L MOPS,0.1%（V/V）Triton X-100,1%PVP-10,0.5%（V/V）Tween20,pH 7.5,离心处理转速2,000～3,000 rpm,温度4℃,时间5～8 min,染色处理前需1,000 mg·L的Rnase A酶进行酶解,加入1,000 mg·L的PI染料后混匀,于4℃黑暗处放置20～30 min,上机检测效果最佳。（3）DNA条形码研究利用DNA条形码研究综合发现,推荐核基因片段ITS和叶绿体DNA片段matK作为核心DNA条形码,二者均能鉴别出除钩距虾脊兰（***）以外的广义虾脊兰属植物。核基因片段ITS和叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA的扩增率和测序成功率均为100%,只有ITS序列长度（664 bp）最符合标准DNA条形码长度（300～800bp）。变异率排列为ITS（81.17%）rbcL（71.91%）trnH-psbA（24.20%）matK（18.46%）。鉴定效率依次为ITS（49.6%）matK（43.8%）trnH-psbA（33.6%）rbcL（31.3%）。综合以上研究结果发现:DUS测试方法可借鉴作为广义虾脊兰属植物物种鉴定方法,且有效可行,可推广至其他科属物种的形态学鉴定;单独用倍性分析及其基因组大小来鉴定广义虾脊兰属材料方案效果不佳,可以给其他鉴定方法提供辅助,但流式细胞实验及其结果无疑可为广义虾脊兰属植物杂交育种提供理论基础;DNA条形码鉴定快速,推荐mat K及ITS序列作为广义虾脊兰属植物的核心条形码并辅以形态学分析加以鉴定广义虾脊兰属植物。