环境浓度下磺胺类药物对斑马鱼早期发育毒性和神经行为机制影响的研究

作     者：霍文博 

作者单位：河南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李卫国;裴得胜

授予年度：2023年

学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：磺胺类药物 发育毒性 神经行为 叶酸代谢 碳酸酐酶代谢 斑马鱼 

摘      要：抗生素由于其稳定性和释放后的抗降解性,可以长期存在于自然界中,对环境及相关生物产生影响。然而,环境浓度下抗生素毒性的分子机制,特别是磺胺类药物（sulfonamides,SAs）的潜在神经毒性仍不清楚。环境浓度下（environment relevant concentrations,ERCs）的SAs对动物模型的生理、行为和机制影响是目前探索人类发育疾病和神经行为影响因素的关键技术,动物神经行为研究方法的出现使人类对抗生素影响神经行为的探索进入了新的研究时代。斑马鱼模型在行为分析中,可以基于简单的行为端点,以各种深入的运动模式,灵敏、快速地评估多种化合物的毒性,可通过毒理学实验和神经行为学研究,揭示发育过程中应激调节的潜在机制和高通量行为测试。本研究搜集环境浓度下SAs的污染浓度,利用毒理学、行为学、机制研究等方法,分析评估了6种SAs对斑马鱼发育毒性和神经行为的影响,为SAs对宿主发育的神经行为的调控机制研究做了充分的准备。本实验主要内容如下:（1）SAs环境浓度的调查和选择目的:了解SAs环境条件下的污染浓度选择合适的实验浓度。方法:输入磺胺类抗生素、河流污染、抗生素污染等词语,在中国知网（CNKI）、Web of Science（SCI）、National Center for Biotechnology Information（NCBI）以及其他网站查询SAs环境污染的相关论文进行搜集和整理。结果:发现几十种SAs存在于环境中,其中农业废水、垃圾场地下入渗水和生活污水中SAs的浓度主要在ng/L-mg/L之间,而排放河流中的浓度维持在ng/L-μg/L。结论:确定实验使用6种SAs,分别为:磺胺嘧啶（sulfadiazine,SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole,ST）、磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole,SMX）、磺胺异恶唑（sulfisoxazole,SIZ）、磺胺吡啶（sulfapyridine,SPD）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine,SDM）和3个实验浓度（0.05、5和500μg/L）对斑马鱼进行试验。（2）SAs对斑马鱼的发育毒性实验目的:观察SAs在环境浓度下对斑马鱼的形态学、器官发育等基础生理数据的影响。方法:分别在受精后（hours post-fertilization,hpf）8 hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf、120 hpf用体视显微镜进行数据采集,在8 hpf时记录死亡和卵黄水肿个数,24hpf记录死亡、无尾伸展个数和30 s内自主运动次数,48 hpf记录死亡、凝血个数和10s内心跳次数,72 hpf记录死亡个数,96 hpf计算并观察各个样本的总存活率、总死亡率和总畸形率,其中畸形形态主要记录:心包水肿、轴畸形、鱼鳔缺失等异常形态,120 hpf时每个样本随机选20枚记录体长数据和每个样本30枚的总体重数据,然后进行样本收集处理。结论:SAs在环境浓度下可导致斑马鱼发生不同程度的畸形现象,与对照组相比实验组斑马鱼的24 hpf自主运动次数下降,48 hpf心率降低,96 hpf存活率降低,畸形率升高,120 hpf体长降低,体重降低。并且随着浓度的升高这些现象更加明显。（3）SAs对斑马鱼的行为学影响目的:观察SAs在环境浓度下主要通过那些方面对斑马鱼行为学产生影响的,并判断该行为会产生什么样的结果。方法:利用Danio Vision（?）仪器记录120 hpf的对照组和实验组斑马鱼在黑暗10分钟和光明暗刺激行为实验下的游泳行为（n=26）,利用计算机跟踪软件Etho Vision XT（?）采集和分析游泳数据。结果:SAs在环境浓度下能够降低斑马鱼的移动距离、平均速度、加速度最大值和最小值、移动时间、狂躁累计时间、活跃累计时间以及活跃性平均值,增加未移动时间和静止累计时间,光明暗刺激行为实验证明了斑马鱼在行为上更加喜好黑暗环境,在黑暗环境条件下更加活跃。移动方式为贴壁游泳,轨迹较为均匀。结论:在行为学上,实验组斑马鱼与野生组相比,实验组的行为能力明显降低,且静止和未移动时间明显增加,可导致斑马鱼在行为上出现抑郁样行为。（4）SAs对斑马鱼的潜在的神经影响机制目的:探索SAs在环境浓度下对斑马鱼神经行为的潜在的调控机制和影响方式。方法:提取并纯化在120 hpf的斑马鱼幼鱼的总基因组DNA进行实时荧光定量PCR分析。结果:随着浓度的升高,SAs可降低叶酸（tetrahydrobiopterin,BH）合成的关键酶墨喋呤还原酶（sepiapterin reductase,SPR）的基因spra表达,从而影响神经递质包括多巴胺（dopamine,DA）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的关键酶: