香鱼致病性类志贺邻单胞菌的分离与生化药敏鉴定
作者单位：宁波大学
学位级别：硕士
导师姓名：苗亮;张立宁
授予年度：2022年
摘 要：本文以从患体表溃烂病的香鱼（Plecoglossus altivelis）和分离自患病香鱼体内的病原菌为研究对象,描述了患病香鱼的病理症状,研究了患病香鱼的5种组织的病理学变化,利用自动微生物鉴定系统配合相应鉴定卡和分子生物学方法对分离得到的三个菌株进行种属鉴定,人工感染后确定了NH21菌株为此次香鱼病害的病原菌,经回归感染确定了该菌株对香鱼的致病性,计算半致死量(lethal does 50%,LD),对25种抗生素进行药敏试验,为今后香鱼养殖中出现类似病症的预防和治疗提供了参考资料。主要结果如下:病鱼的病理症状表现为皮肤和肌肉组织溃烂,溃烂处鳞片和皮肤脱落,周围皮肤充血,肌肉组织突出,肛门红肿;解剖后可发现肠道肿胀变薄,肠道充血、出血,肠腔内有淡黄色炎性黏液。组织病理学研究表明患病香鱼体表溃烂处肌纤维断裂,周围可见红细胞、炎性细胞浸润,呈坏死性肌炎表现;鳃丝和鳃小片中红细胞增多,鳃丝间细胞和粘液细胞增多,细胞边界不明显,有淋巴细胞浸润,部分鳃丝上皮细胞瓦解;病鱼肝细胞的细胞核呈空泡样,部分肝细胞与周围肝细胞之间产生缝隙而被“隔离,核内染色质边集,部分细胞凋亡、溶解;患病香鱼脾脏内红细胞数量减少,细胞排列不规则,白细胞聚集,核深染,细胞之间出现空泡;肠腔内黏膜上皮细胞脱落,在肠腔内溶解。从患病鱼体表和肠道组织中分离到三株菌,命名为NH21、AHN2和AVH3,它们在TSA（Tryptose soya agar,胰酪大豆胨琼脂培养基）平板上生长的的菌落低突,边缘光滑,表面湿润。革兰氏染色结果显示三株菌均为革兰氏阴性菌,菌形态为短杆状,端圆。经生理生化特征和16S r DNA序列分析分别鉴定为类志贺林单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）,分别命名为NH21、AHN2和AVH3。在以金黄色葡萄球菌为外群构建的系统进化树中,分离菌株NH21、AHN2和AVH3分别与同种菌株聚为一簇,嗜水气单胞菌与维氏气单胞菌的菌株聚为一大簇,三株菌与同种菌株的同源性都大于99%,作为外群的金黄色葡萄球菌单独成簇。AHN2和AVH3菌株经人工感染后的香鱼表现出体黑,游动缓慢,轻微浮头等症状,与文献中的描述相似,而NH21感染后的香鱼表现出肛门红肿,鳍基部充血的症状,与自然感染的香鱼症状相似,确定菌株NH21为此次香鱼体表溃烂病的病原。经回归感染后,使用改良的寇式计算法计算可得菌株NH21的半致死量LD为2.51×10～7CFU/m L。25种抗生素的药敏试验结果显示菌株NH21对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多粘菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感,对麦迪霉素、氨苄西林、羧苄西林、阿莫西林、链霉素、卡那霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素、多西环素、四环素、磺胺异噁唑、氧氟沙星耐受;对红霉素、克拉霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明6种抗生素处于中介状态。毒力基因与耐药基因实验检出菌株NH21毒力基因feo B、csr A、ssb、pho P、csg G、waa A、pan D、sod B、clp P共9个,不存在毒力基因nan E和hsd M;耐药基因emr D、cat B、mac B、ksg A、tol C、amp E、bac A、acr A均在菌株NH21中被检测到。综上所述,本文首先对患体表溃烂病香鱼的病理症状进行了描述,随后进行了组织病理学研究。病原菌分离共分得三个菌株,经生化特征鉴定和16S r DNA序列分析确定三个菌株分别是类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌。经人工感染后,确定类志贺邻单胞菌为此次香鱼体表溃烂病的病原菌。同时,针对NH21菌株通过回归感染试验、药敏试验、毒力基因与耐药基因试验,确定了分离菌株NH21的一些菌株特性。
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