牛肝菌中总黄酮提取纯化及抗氧化活性研究

作     者：么越 

作者单位：牡丹江师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：姜明;李敏敏

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 

主      题：牛肝菌 黄酮 提取纯化 成分鉴定 抗氧化性 

摘      要：牛肝菌（Boletus）为大型野生真菌,极具食药用和经济价值。本课题以牛肝菌为研究对象,优化总黄酮提取纯化工艺,结合光谱质谱技术鉴定出19种黄酮成分。通过体外抗氧化试验,进一步明确其抗氧化能力,为牛肝菌总黄酮（Boletus Flavonoids,B-Fla）的进一步开发利用提供理论与技术支持。主要研究结果如下:（1）单因素结合Box-Behnken响应面设计法,研究乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间对B-Fla提取效果的影响,得出其最优提取条件:超声时间143.60 min、超声温度71.20℃、乙醇浓度72.30%和料液比为1:35 g/m L,此时B-Fla提取量可达到18.20mg/g。基于最佳提取工艺,对云南省4个市的16个牛肝菌样品进行黄酮含量的比较,结果表明香格里拉市的红葱牛肝菌中总黄酮含量最高,可达到19.68±1.29 mg/g,因此选用该牛肝菌进行下一步的纯化与鉴定。（2）比较7种大孔树脂（HP20、X-5、D101、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD400、AB-8）及聚酰胺对B-Fla的吸附率及解吸率的影响。结果表明,NKA-9为最佳选择,吸附率及解吸率分别为44.22%和75.64%。进一步试验得出静态最佳吸附与解吸条件分别为:吸附平衡时间3 h,上样浓度10 mg/m L,上样液/洗脱液p H值均为3,洗脱液浓度70%。确定NKA-9对B-Fla动态吸附与解吸条件为:上样体积4 BV,洗脱液用量11 BV,上样液流速与洗脱流速均为1.5 m L/min。按照优化后的纯化条件纯化2次,得到B-Fla含量为321.80 mg/g,是粗提物总黄酮含量的16.35倍。并通过扫描电镜观察粗提物和纯化物之间的区别,发现纯化物表面更为光滑,组织更为紧密。结合紫外吸收光谱在250-550 nm之间的吸收带和傅里叶红外在4000-400 cm之间的吸收峰对纯化物进行初步研究,发现其具有黄酮类化合物的特征吸收峰,初步证实纯化所得物质含黄酮类化合物。通过Q Exactive Focus组合四极杆Qrbitrap质谱仪进一步鉴定出纯化物中共有19种黄酮成分。并通过高效液相色谱对对羟基肉桂酸、山姜素、丁香醛、瑞香素、甘草素、刺甘草查尔酮和七叶亭7种成分进行定量分析,含量依次为1.69、0.69、1.79、1.39、0.62、1.54和1.22 mg/g。（3）化学抗氧化活性评价:以Vc为阳性对照,通过对DPPH、ABTS、超氧阴离子及羟基自由基清除率的测定,初步评价B-Fla粗提物及纯化物体外抗氧化活性。结果表明,B-Fla粗提物和纯化物对DPPH、ABTS、超氧阴离子及羟基自由基均有清除能力,纯化物对其清除能力显著高于粗提物,且呈剂量依赖性。在相同浓度下,对4种物质清除力由高到低分别是羟基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基和超氧阴离子,B-Fla纯化物对羟基自由基的清除能力甚至超过Vc阳性对照,可达到92.80%,证明其有较好的抗氧化能力。细胞氧化活性评价:B-Fla对HepG2氧化损伤影响研究。测定细胞内丙二醛（MDA）水平和抗氧化酶（CAT、SOD、GPX）含量变化,试验结果表明:B-Fla化合物降低HO诱导细胞内MDA的产生,增加SOD、CAT、GPx的含量,使抗氧化能力增强。采用实时定量PCR技术对Nrf2/Keap1信号通路上相关基因（Keap1、Nrf2）及其下游抗氧化基因（SOD、CAT、GPx、NQO1、HO-1）进行分析,与模型组相比,用药组Nrf2基因显著上调,抑制Keap1基因表达,下游基因NQO1、HO-1、SOD、CAT、GPx均显著上升。综上所述,B-Fla纯化物具有良好的抗氧化能力,该试验的研究结果可为牛肝菌资源的进一步开发和利用提供技术支持及数据参考。