巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对脊髓损伤大鼠炎症调控的作用研究

作     者：邓智中 

作者单位：延安大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈雅慧

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：脊髓损伤 小胶质细胞 巨噬细胞迁移抑制因子 ISO-1 炎症反应 

摘      要：研究背景: 脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种毁灭性的疾病,会对患者生理、心理以及其家人与社会造成很重的负担,目前仍缺乏有效治疗手段。巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)作为一种多效性的生物因子,近年来在肿瘤、自身免疫性等疾病中被广泛研究。但是其在中枢神经系统中,特别炎症方向的研究仍旧很少。ISO-1作为MIF的一款经典抑制剂,其衍生物已被应用于包括多发性骨髓瘤(Multiple myeloma)等疾病的临床实验中。本实验将探究ISO-1对于SCI的作用,以及MIF在SCI后炎症反应中扮演的角色。 目的: 1.通过脊髓损伤大鼠模型,探究巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对于脊髓损伤大鼠的组织形态、神经元以及运动功能的作用;2.通过建立脊髓损伤大鼠模型,探讨巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对于脊髓损伤大鼠炎症反应的影响及机制;3.明确ISO-1对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应的影响及机制。 方法: 1.雌性SD大鼠(230g左右),用HI-0400脊髓打击器打击大鼠脊髓T10段,建立大鼠急性SCI模型;之后腹腔注射ISO-1(2mg/kg)。将大鼠随机分为Sham组、SCI组、SCI+DMSO组和SCI+ISO-1组四组。BBB量表评价不同分组大鼠运动功能恢复情况;HE染色观察不同分组大鼠脊髓组织形态学变化;尼氏染色观察不同分组大鼠脊髓组织尼氏体变化。 *** Blot检测脊髓损伤大鼠巨噬细胞迁移抑制因子MIF随损伤时间变化的趋势及不同分组大鼠脊髓损伤区域MIF、炎症相关通路NF-κB及炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。免疫荧光染色检测不同分组大鼠脊髓损伤区域MIF、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β表达。 3.通过CCK-8筛选出最适的LPS诱导浓度,建立小胶质细胞的炎症模型;通过CCK-8筛选出后续实验所需的最适ISO-1保护浓度。将小胶质细胞分为Control组、LPS组、LPS+ISO-1组三组。免疫荧光和Western Blot检测不同分组小胶质细胞M1型标志物INOS及小胶质细胞M2型标志物Arg-1、MIF、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达;电镜白光观察不同分组小胶质细胞形态变化;TUNLE染色观察不同分组小胶质细胞凋亡情况。 结果: ***评分结果显示:SCI+ISO-1组的分数自损伤7d后明显高于SCI+DMSO组;Sham组的评分高于SCI组。HE染色结果显示:Sham组脊髓组织形态完整,结构正常,无明显损伤;SCI组及SCI+DMSO组脊髓组织有大量空洞存在,损伤明显,结构疏松,神经元破碎,存活数量减少;与SCI+DMSO组相比,SCI+ISO-1组脊髓组织形态更加完整,空洞减少,结构较为紧密,神经元存活数量较多,核仁较为明显,轮廓相对清晰。尼氏染色结果显示:Sham组脊髓灰质形态完整,尼氏体轮廓清晰,排列整齐;SCI组及SCI+DMSO组脊髓灰质损伤明显,结构疏松,组织之间不紧密,尼氏体破碎,存活数量减少;与SCI+DMSO组相比,SCI+ISO-1组脊髓灰质更加完整,结构较为紧密,尼氏体存活数量较多,轮廓相对清晰。 *** Blot结果显示:SCI大鼠MIF蛋白表达量随损伤时间而变化,在损伤后3d时MIF蛋白表达达到高峰;SCI组及SCI+DMSO组MIF、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达相对于SCI+ISO-1组上调。SCI组及SCI+DMSO组MIF、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白免疫荧光染色结果与Western Blot结果一致。 3.用浓度为700ng/m L的LPS刺激小胶质细胞24 h,得到的细胞相对活力最适合后续实验,通过CCK-8法筛选出ISO-1的最佳保护浓度为4μM。 4.电镜白光结果显示:Control组小胶质细胞多呈静息态,细胞形态较小,呈多角形,部分有伪足,边界清晰;LPS组小胶质细胞多呈阿米巴样态,胞体变大变圆且呈多形态改变,细胞内有空泡形成;ISO-1组小胶质细胞形态介于正常对照组与LPS处理组之间。Western Blot结果及免疫荧光结果显示:LPS+ISO-1组相较于LPS组小胶质细胞Arg-1蛋白上调、INOS蛋白下调。 *** Blot及免疫荧光结果显示:LPS+ISO-1组相较于LPS组小胶质细胞MIF、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达量下调。 ***染色结果显示LPS+ISO-1组相较于LPS组小胶质细胞凋亡减少。 研究结论: ***-1可以促进由SCI引起的SD大鼠的组