Twist1抑制剂Harmine抑制肾脏纤维化的安全性及有效性研究
作者单位：中国人民解放军空军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：孙世仁;刘利敏
授予年度：2023年
主 题：Twist1 Harmine 肾脏纤维化 慢性肾脏病 IC50 LD50
摘 要：【背景】目前全球多达10%的成年人患有慢性肾病(CKD),其中约8.5亿人患有不同类型的肾脏疾病。肾脏纤维化是各种CKD发生发展所共有的病理表现。目前缺乏直接抑制肾脏纤维化的药物。抗肾纤维化药物的开发是延缓CKD的进展,改善CKD患者的预后的关键点之一。课题组前期研究证实转录因子Twist1在促进肾脏纤维化过程中发挥着重要作用。提出Twist1可能是抗肾纤维化的有效干预靶点。Harmine是一种β-碳碱生物碱,在许多植物中都有发现。在一项无偏筛选中,Harmine被首次发现可以有效抑制Twist1,在肺癌中具有显著抗肿瘤活性。Harmine处理可导致非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Carcinoma,NSCLC)细胞的Twist1降解,诱导细胞衰老或凋亡。因此,Harmine是否能作为有效的抗肾纤维化的药物,值得进一步研究。为此,我们通过收集原发性肾小球病Ig AN患者和DN患者的肾脏活检组织标本进行Mssson染色、纤维化因子α-SMA以及Twist1的免疫组化染色并进行了生存分析探索了Twist1在CKD患者的肾活检组织标本中的表达与肾纤维化及e GFR的相关性;MTT实验和LD实验初步评定了Hamrine在体内体外的安全性;以及体内外实验验证了Harmine通过抑制Twist1进而抑制肾脏纤维化的作用,为进一步探究Harmine的抗纤维化的临床前研究奠定基础。【目的】本研究旨在探索Twist1抑制剂Harmine抑制肾脏纤维化的有效性及安全性,为进一步探索抑制肾脏纤维化的临床用药奠定基础。1.探索CKD患者肾组织Twist1高表达与纤维化程度的相关性。2.通过体内外实验对Harmine的安全性进行初步评价。3.通过体内外实验对Harmine缓解肾脏纤维化的有效性进行研究。【方法】1.收集原发性肾小球病Ig AN患者和DN患者的肾脏活检组织标本进行Mssson染色、纤维化因子α-SMA以及Twist1的免疫组化染色,对染色结果进行相关性分析,以此探究Twist1在CKD患者的肾活检组织标本中的表达与肾纤维化及e GFR的相关性。2.分别用人肾小管上皮细胞系HK-2,HKC-8,小鼠肾小管上皮细胞BUMPT以及大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E进行MTT实验,分别计算Harmine在四种细胞中24h,48 h以及72 h的半数抑制浓度(IC),以此评价Harmine在体外的安全性。设置不同浓度梯度,C57小鼠腹腔注射Harmine进行半数致死量(LD)检测,观察小鼠给药后60分钟内的反应及状态,每日给药前记录体重,一周后取重要脏器进行HE染色以及血清肝肾功能检测,以此评价Harmine在体内的安全性。3.利用缺氧孵箱设24 h,48 h两个时间梯度缺氧处理HK-2细胞,并同时进行Harmine给药处理,根据前期LD结果设置三个适宜的浓度梯度,在蛋白和RNA水平对Harmine对Twist1的抑制作用及对促纤维化因子的抑制作用进行评价。利用野生型(Wild Type,WT)C57小鼠以及Twist1小鼠构建单侧肾脏缺血再灌注(unilateral ischemic re-perfusion injury,u IRI)肾脏纤维化模型,腹腔注射不同浓度梯度的Harmine溶液。由于目前临床没有显著有效的抗纤维化药物,鉴于盐酸贝那普利可通过降低肾脏高内压、高滤过、高灌注而去改善肾脏功能,发挥部分缓解肾纤维化表型的作用,因此,同时,设立一组u IRI+盐酸贝那普利灌胃组作为阳性对照组。14天后取肾脏组织进行HE、Masson、PAS染色以及免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色,并在蛋白和组织形态学水平对Harmine在抑制肾脏纤维化过程中的有效性进行评价。【结果】1.经相关性分析发现,Twist1表达越高,纤维化程度越重,同时e GFR越低。2.通过MTT实验成功计算出了四种细胞系在24 h,48 h以及72 h的IC值,在HK2细胞中,Harmine在24 h,48 h以及72 h的IC值分别为86.44μmol/L,89.18μmol/L,以及30.50μmol/L;在HKC-8细胞中,Harmine在24 h,48 h以及72 h的IC值分别为117.61μmol/L,20.72μmol/L,以及18.30μmol/L;在小鼠肾小管上皮细胞BUMPT中,其在三个时间点的IC值分别为21.82μmol/L,11.32μmol/L,以及6.31μmol/L;在NRK-52E细胞中,Harmine在24 h,48 h以及72 h的IC值分别为51.43μmol/L,19.82μmol/L,以及16.16μmol/L。为后续细胞给药处理实验提供了浓度参考,并对Harmine在体外的安全性进行了评价。成功计算出Harmine在C57小鼠体内的LD为36.87mg/kg,此外,通过小鼠给药后的行为,每日体重的变化以及血清肝肾功能,发现当腹腔注射Harmine的给药浓度超过20 mg/kg后,小鼠开始出现活动增加,亢奋,随着浓度进一步增大,小鼠出现抽搐,震颤,共济失调直至中毒死亡。而心肝脾肺肾的组织病理学染色及血清肝肾功能检测未发现差异。3.HK2细胞培养基中加入Harmine并进行缺氧处理24 h、48 h,Twist1和纤维化指标的表达下调,且呈时间及剂量依赖性。u IRI小鼠腹腔注射Harmine可以抑制Twist1的表达,且减轻了u IRI小鼠的纤维化表型。与Twist1小鼠以及u IRI+盐酸贝那普利对照组的纤维化减轻的表型一致。【结论】1.慢性肾脏病患者肾组织中Twist1的表达与纤维化程度呈正相关,Twist1的表达与e GFR水平呈负相关。2.Harmine在不同的细胞系中的IC有区别,Harmine在小鼠体内的LD值为36.87 mg/kg,腹腔注射Harmine超过20 mg/kg后,小鼠开始出现神经兴奋症状,当浓度过高时则出现神经中毒症状。而血清学肝肾功能检测及重要脏器组织病理学染色未发现明显差异。3.缺氧诱导的人肾小管上皮细胞Twist1表达上调以及纤维化表型可被Harmine抑制,且呈时间依赖性及剂量依赖性。在u IRI模型模拟的肾脏纤维化模型中,腹腔注射Harmine可减轻肾脏纤维化表型。与Twist1小鼠及盐酸贝那普利阳性对照组的表型一致。
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