脂肪酸代谢改变在锰诱导的A1型星形胶质细胞活化中的作用及机制

作     者：巫金霞 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈景元;苏鹏

授予年度：2023年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：锰 神经毒性 星形胶质细胞 脂肪酸代谢 

摘      要：锰是机体所必需的金属微量元素,然而过量锰暴露会引起锰在体内蓄积,造成锰中毒。环境因素与职业因素是锰暴露的重要来源,过量的锰在中枢神经系统中主要沉积于基底节区,从而引起运动功能损伤,在临床中以类帕金森病的症状表现为主。锰的神经毒性是多种神经退行性疾病发生发展的一个重要环境危险因素,但其具体发病机制尚未完全阐明,本课题试图发现星形胶质细胞在其中发挥的作用及具体机制。星形胶质细胞是血脑屏障的重要组成部分,在维持神经元的功能方面发挥关键作用。在内外界刺激下,静息状态的星形胶质细胞会发生活化。将活化的星形胶质细胞根据其分子特征和功能的不同,分为起神经损伤作用的“A1型和起神经保护作用的“A2型。在多种神经退行性疾病患者的大脑中发现了大量存在的活化的A1型星形胶质细胞,并且该类型细胞与神经退行性疾病的发病机制密切相关。本课题组前期研究结果表明锰暴露可以诱导星形胶质细胞A1型活化,且其活化会引起神经元损伤,但锰暴露导致星形胶质细胞A1型活化的机制尚不清楚。有研究发现脂肪酸可通过参与A1型星形胶质细胞活化的毒性作用,引起少突胶质细胞和神经元功能障碍甚至死亡,表明脂肪酸代谢可能在A1型星形胶质细胞活化中发挥重要作用。脂肪酸代谢是脂质代谢中最核心的基本代谢过程,在维持中枢神经系统的正常生理功能发挥关键作用,同时也参与多种神经退行性疾病的发病机制。通过代谢组学检测分析发现锰的神经毒性也伴随着脑内脂质代谢的改变,其中脂肪酸代谢物改变明显,但锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸代谢的影响尚不清楚,其是否参与锰暴露后星形胶质细胞的A1型活化也尚未明确。目的:本研究通过建立锰暴露的体内外模型验证锰暴露对A1型星形胶质细胞活化的影响,阐明锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸代谢的影响,揭示脂肪酸代谢改变在锰诱导的A1型星形胶质细胞活化中的作用,探究干预脂肪酸代谢对锰诱导的A1型星形胶质细胞活化及其毒性效应的影响,为锰神经毒性的机制研究和防治手段提供新的策略和理论基础。方法:1.采用皮下注射锰溶液(100 mg/kg)两周的方式建立锰暴露小鼠模型,采用原子吸收光谱检测小鼠的血锰含量;通过行为学实验(旷场实验、爬杆实验、步态分析实验)检测锰暴露对小鼠运动行为能力的影响;采用TH免疫荧光染色检测锰暴露对黑质区多巴胺能神经元数量的影响;采用C8-D1A星形胶质细胞系和磁珠分选培养的原代星形胶质细胞,建立锰暴露细胞模型。2.通过RT-q PCR及免疫荧光染色的方法,检测锰暴露后星形胶质细胞A1活化相关标志分子的转录水平和蛋白水平的表达。3.通过星形胶质细胞和多巴胺能神经元的条件共培养,采用Orobors O2K线粒体耗氧分析,检测锰暴露诱导的A1型星形胶质细胞活化对多巴胺能神经元线粒体功能的影响。4.通过脂质组学检测锰暴露后星形胶质细胞的脂质代谢产物,采用油红O染色和BODIPY 493/503染色,对锰暴露后星形胶质细胞的脂滴形成进行检测。5.通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸氧化功能的影响;采用一种发荧光的外源性脂肪酸类似物BODIPY 500/510 C1,C12(又称C1-BODIPY 500/510 C12),检测锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸摄取功能的影响;采用RT-q PCR检测锰暴露后星形胶质细胞的脂肪酸摄取、合成及氧化代谢过程相关重要分子在转录水平的表达。6.通过二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)抑制剂抑制脂滴形成,干预脂肪酸代谢,采用RT-q PCR检测星形胶质细胞A1活化相关标志分子的转录水平,明确脂滴形成在锰诱导星形胶质细胞A1型活化中的作用;运用Orobors O2K线粒体耗氧分析检测抑制脂滴形成对锰诱导的A1型星形胶质细胞毒性效应的影响。7.采用芝麻酚(一种小分子物质)干预脂肪酸代谢,通过脂质组学检测芝麻酚对锰暴露后星形胶质细胞的脂质代谢物及脂肪酸代谢的影响;通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测芝麻酚对锰诱导的星形胶质细胞脂肪酸氧化功能损伤的影响;采用RT-q PCR检测芝麻酚对锰诱导星形胶质细胞A1型活化的作用;运用Orobors O2K线粒体耗氧分析检测芝麻酚对锰诱导的A1型星形胶质细胞毒性效应的影响。结果:1.锰暴露对星形胶质细胞A1型活化及其对神经元毒性效应的影响(1)建立锰暴露小鼠模型验证锰神经毒性采用皮下注射的方法进行小鼠锰暴露后,小鼠的血锰含量显著升高;通过爬杆实验、旷场实验、步态分析实验检测小鼠运动能力,结果表明锰暴露后小鼠的运动能力下降;采用TH免疫荧光染色检测发现锰暴露后小鼠黑质区多巴胺能神经元数量减少。(2)锰暴露对星形胶质细胞A1型活化的影响在体内实验中,通过RT-q PCR检测锰暴露后纹状体及黑质区星形胶质细胞A1特异性标志物转录水平的表达,结果发现锰暴露后部分A1特异性标志物的转录水平明显升高;并且通过免疫荧光染色检测纹状体区星形胶质细胞的形态和A1特异性蛋白标志物C3的表达,结果显示锰暴露后星形胶质细胞体积增大,分枝增多增粗,C3阳性星形胶质细胞数量显著增多。在体外实验中,分别采用C8-D1A星形胶质细胞系和原代星形胶质细胞建立锰暴露细胞模型,RT-q PCR结果均显示锰暴露后星形胶质细胞部分A1特异性标志物的转录水平显著升高,与体内结果基本一致,均表明锰暴露可引起星形胶质细胞A1型活化。(3)锰诱导的A1型星形胶质细胞对神经元的毒性效应采用星形胶质细胞条件培养基培养SN4741多巴胺能神经元的方法,通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测锰诱导的A1型星形胶质细胞活化对SN4741细胞线粒体耗氧功能的影响,结果表明锰诱导的A1型星形胶质细胞可以损伤多巴胺能神经元的线粒体耗氧功能。2.锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸代谢的影响1)脂质组学分析锰暴露后星形胶质细胞内脂质代谢物的变化通过脂质组学方法检测锰暴露后星形胶质细胞内的脂质代谢物,首先主成分分析显示锰暴露后星形胶质细胞内脂质代谢物总体较对照组发生明显变化;其次对锰暴露后星形胶质细胞内差异脂质代谢物进行分析显示,锰暴露后星形胶质细胞内有192种脂质代谢物发生显著变化,其中上调的有81种,下调的有20种,并且通过热图分析显示锰暴露后星形胶质细胞中大部分脂质代谢物的含量增多;最后对锰暴露后排名前二十的优势代谢物进一步分析发现,锰暴露后星形胶质细胞内的脂肪酸代谢改变明显,主要表现为游离脂肪酸均显著升高。上述结果表明锰暴露可引起星形胶质细胞脂质代谢紊乱,其中脂肪酸代谢改变明显。2)锰暴露对星形胶质细胞内脂滴形成的影响为了进一步验证脂质组学的结果,采用甘油三酯含量检测试剂盒检测锰暴露后星形胶质细胞内的甘油三酯含量,结果表明锰暴露可以引起星形胶质细胞内甘油三酯含量升高。上述结果表明锰暴露可引起星形胶质细胞内游离脂肪酸水平和甘油三酯含量升高,呈现脂质累积的情况。因此为了进一步明确锰暴露后星形胶质细胞内脂质的异常积累,我们检测锰暴露后星形胶质细胞内脂滴形成情况。采用油红O染色的方法检测细胞内的脂滴,结果发现锰暴露后星形胶质细胞内的脂滴形成增多;通过脂滴的BODIPY染色也发现,锰暴露后原代星形胶质细胞的脂滴数量增多,平均面积显著增大。上述结果均表明锰暴露可引起星形胶质细胞内脂滴形成增多。在体内实验中,采用BODIPY 493/503染色检测锰暴露后黑质区星形胶质细胞内的脂滴形成,结果提示锰暴露可能引起黑质区脂质累积和星形胶质细胞内脂滴形成增多。综合以上结果表明锰暴露后星形胶质细胞内的游离脂肪酸、甘油三酯含量升高以及脂滴形成增多,呈现细胞内脂质累积的现象。3)锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸代谢的调控机制(1)锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸氧化代谢的影响通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测星形胶质细胞的脂肪酸氧化功能,结果显示锰暴露后星形胶质细胞的脂肪酸氧化功能降低。在体外实验中,通过RT-q PCR检测锰暴露后星形胶质细胞内脂肪酸氧化代谢相关重要酶(Cpt1-α和Cpt2)在转录水平的表达,结果显示锰暴露后星形胶质细胞内Cpt1-α和Cpt2的转录水平均显著降低;在体外实验中,采用同样方法进行检测,锰暴露后纹状体及黑质区Cpt1-α的转录水平明显降低。锰暴露后星形胶质细胞的脂肪酸氧化功能与其氧化代谢相关酶的转录表达结果是相一致的,表明锰暴露可引起星形胶质细胞脂肪酸氧化代谢损伤。(2)锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸摄取代谢的影响采用一种发荧光的脂肪酸类似物C1-BODIPY 500/510 C12检测分析显示锰暴露后在一定时间内进入星形胶质细胞内的外源性脂肪酸类似物的平均荧光强度增加,提示锰暴露可能引起星形胶质细胞的脂肪酸摄取功能增强。在体外实验中,通过RTq PCR检测锰暴露后星形胶质细胞内脂肪酸摄取代谢相关重要酶(Fabp7和CD36)在转录水平的表达,结果显示锰暴露后星形胶质细胞内Fabp7的转录水平显著升高;与体外结果基本一致,锰暴露后纹状体及黑质区Fabp7的转录水平明显升高。锰暴露后星形胶质细胞的脂肪酸摄取功能与其摄取及转运代谢相关蛋白的转录表达结果是相一致的,提示锰暴露可引起星形胶质细胞脂肪酸摄取代谢增强。(3)锰暴露对星形胶质细胞脂肪酸合成代谢的影响在体外实验中,通过RT-q PCR检测锰暴露后星形胶质细胞内脂肪酸合成代谢相关重要酶(ASSS2、ACLY、ACC、FASN、SCD1)在转录水平的表达,结果显示锰暴露后星形胶质细胞内ACLY和SCD1的转录水平显著升高,而ACC和FASN的转录表达无明显影响;与体外结果基本一致,锰暴露后纹状体及黑质区ACLY和SCD1的转录水平明显升高。上述结果初步提示锰暴露可引起星形胶质细胞脂肪酸合成代谢增强。3.干预脂肪酸代谢对锰诱导的A1型星形胶质细胞活化的影响1)抑制脂滴形成对锰诱导的A1型星形胶质细胞活化及其毒性效应的影响(1)DGAT1抑制剂对锰诱导的星形胶质细胞内脂滴形成的影响在体外实验中,采用DGAT1抑制剂(A922500),抑制脂滴形成干预脂肪酸代谢,首先通过BODIPY 493/503染色检测DGAT1抑制剂对锰诱导星形胶质细胞内脂滴形成的影响,结果显示,锰暴露后星形胶质细胞内脂滴平均面积增大,而DGAT1抑制剂可以减少锰暴露后星形胶质细胞内脂滴平均面积。然后采用流式细胞术检测细胞内的脂滴,其结果与上述基本一致,显示DGAT1抑制剂可以降低锰暴露后星形胶质细胞内脂滴BODIPY荧光强度。上述结果表明DGAT1抑制剂可以抑制锰诱导的星形胶质细胞内的脂滴形成。(2)DGAT1抑制剂对锰诱导的A1型星形胶质细胞活化及其毒性效应的影响通过RT-q PCR检测DGAT1抑制剂对锰诱导星形胶质细胞A1型活化的影响,结果显示抑制脂滴形成后星形胶质细胞大部分A1特异性标志物的转录水平显著下降,表明抑制脂滴形成可以部分抑制锰诱导的星形胶质细胞A1型活化。在体外实验中,采用星形胶质细胞条件培养基培养SN4741多巴胺能神经元的方法,通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测SN4741细胞的线粒体耗氧率,结果表明抑制脂滴形成减少A1型星形胶质细胞活化可改善对神经元线粒体耗氧功能的损伤。2)芝麻酚对锰诱导的A1型星形胶质细胞活化及其毒性效应的影响(1)芝麻酚对锰神经毒性的影响在体内实验中,建立芝麻酚和锰暴露的小鼠模型,爬杆实验和旷场实验的结果表明芝麻酚可部分改善锰暴露后小鼠运动平衡能力损伤;采用TH免疫荧光染色的方法,结果发现芝麻酚可部分减轻锰暴露后小鼠黑质区多巴胺能神经元的损伤。通过透射电镜,结果初步提示芝麻酚可能部分改善黑质区锰暴露引起的星形胶质细胞线粒体结构损伤。上述结果均表明芝麻酚在锰神经毒性中发挥保护作用。(2)芝麻酚对锰诱导A1型星形胶质细胞活化及其毒性效应的影响在体内实验中,采用RT-q PCR方法检测芝麻酚对锰暴露后纹状体及黑质区星形胶质细胞A1特异性标志物表达的影响,结果表明芝麻酚可以显著降低锰暴露后纹状体及黑质区星形胶质细胞部分A1特异性标志物的转录水平;在体外实验中,采用同样方法检测芝麻酚对锰诱导星形胶质细胞A1型活化的影响,结果与体内结果一致,均支持芝麻酚可以部分抑制锰诱导的星形胶质细胞A1型活化。采用条件培养基的方法,通过Orobors O2K线粒体耗氧分析检测SN4741细胞的线粒体耗氧率,结果表明芝麻酚减少A1型星形胶质细胞活化可减轻对神经元线粒体耗氧功能的损伤。(3)芝麻酚对锰诱导的星形胶质细胞脂肪酸改变的影响为了探究芝麻酚对锰诱导的星形胶质细胞脂质代谢改变的影响,通过脂质组学的结果分析发现芝麻酚可以降低锰暴露后星形胶质细胞内的部分脂质代谢物,包括其中的游离脂肪酸,提示芝麻酚对锰诱导的星形胶质细胞脂质代谢改变产生作用。采用Orobors O2K线粒体耗氧分析检测芝麻酚对锰诱导损伤的星形胶质细胞的脂肪酸氧化功能的影响,结果显示芝麻酚可部分改善锰暴露后星形胶质细胞的脂肪酸氧化功能损伤。结论:1.星形胶质细胞A1型活化是锰神经毒性的重要机制。2.脂肪酸代谢改变是锰诱导星形胶质细胞A1型活化的重要机制。3.干预脂肪酸代谢对锰诱导的A1型星形胶质细胞的毒性效应起到保护作用。