两株DHAV-3毒株全基因组测序及重组酶介导等温扩增DHAV-1和DHAV-3检测方法的建立与应用

作     者：潘思丞 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韦天超

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：1型鸭甲肝病毒 3型鸭甲肝病毒 基因组全序 序列分析 遗传变异 重组酶介导等温扩增 应用 

摘      要：鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)是一种严重危害3周龄以下雏鸭的疫病病原。该病原可引起雏鸭发生急性感染和高死亡率。目前,我国流行的鸭甲肝病毒是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)和3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。近年来,从广西发病鸭分离鉴定的DHAV-3分离株不断增多。然而,关于广西DHAV-3毒株全基因组序列的报道较少。因此,本研究对2株DHAV-3广西毒株进行全基因序列测定与分析,为本地区分子流行病学研究和疾病防控提供理论依据。分子生物学诊断方法是目前常用的快速鉴别DHAV不同类型病毒的方法。重组酶介导等温扩增(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)是一种新型的分子生物学技术,与普通PCR相比,RAA更省时,操作更简便,有利于基层实验室进行病原的检测。目前,尚未见关于DHAV-1和DHAV-3的RAA检测方法建立的报道。因此,本研究将分别建立DHAV-1和DHAV-3的普通型与荧光型的RAA检测方法,并应用于临床样品的检测。主要的研究内容和结果如下。1.DHAV-3 GXBH180322和GXBH180401株的全基因序列测定根据参考文献合成扩增DHAV-3基因组的特异性引物,对本实验室鉴定的DHAV-3毒株GXBH180322株和GXBH180401株进行基因序列测定分析。结果表明,GXBH180322和GXBH180401株基因全序长度分别为为7785nt和7788nt。上述两个毒株与25株DHAV-3参考毒株之间的全基因组核苷酸相似性在91.5%-99.1%之间,其中GXBH180322株与本实验室2015年分离的参考毒株151202A株核苷酸相似性最高,达到99.1%;而GXBH180401株与从中国东部地区分离到的SD1201株核苷酸相似性最高,为98.0%。但是,它们与越南毒株DN2的核苷酸相似性最低。GXBH180322与GXBH180401株核苷酸相似性高达97.8%。这2株毒株与DHAV-1和DHAV-2参考毒株核苷酸相似性均较低,分别为71.5%-72.3%和76.7%-77.4%。根据DHAV全基因组进行遗传进化分析,结果表明:GXBH180322株和GXBH180401株与其他DHAV-3参考毒株处于进化树的一个在分支上,其中GXBH180322株与广西DHAV-3毒株151202A亲缘关系近,同属于一个小分支;而GXBH180401株形成一个单独的小分支,且与中国其他地区分离株的亲缘关系较近。2.DHAV-1和DHAV-3重组酶介导等温扩增(RAA)普通型检测方法的建立与应用针对DHAV-1和DHAV-3的相对保守且互相特异的VP1基因片段设计不同的特异性引物,并优化普通RAA反应条件,分别建立了DHAV-1和DHAV-3普通RAA检测方法。试验结果表明,DHAV-1和DHAV-3普通RAA的反应时间分别为10min和15min;建立的检测方法特异性好,对其他对照病原体:鸭坦布苏病毒(MUTV)、番鸭细小病毒(MDPV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)没有特异性扩增。DHAV-1和DHAV-3普通RAA检测灵敏度高,每反应模板最小检测量分别为125.78和19.84拷贝。用2种检测方法对75份临床样品进行检测,并用普通PCR法对每一份样品进行平行的检测,结果表明,DHAV-1和DHAV-3 RAA检测出的阳性样品分别为31份和27份,与用普通PCR检测的结果均一致。表明建立的DHAV-1和DHAV-3 RAA可应用于临床样品的检查,而且检测结果可信。3.DHAV-1和DHAV-3重组酶介导等温扩增(RAA)荧光型检测方法的建立与应用根据上述的DHAV-1和DHAV-3的RAA普通引物扩增的基因片段分别设计并合成DHAV-1和DHAV-3的RAA荧光探针,在DHAV-1和DHAV-3的普通RAA法的反应体系分别加入相应的特异性荧光探针,并优化荧光RAA反应条件,建立了DHAV-1和DHAV-3荧光RAA检测方法。试验结果表明,DHAV-1和DHAV-3荧光RAA的反应时间均在20min完成;建立的检测方法特异性好,对其他对照病原体没有特异性扩增。DHAV-1和DHAV-3荧光RAA检测灵敏度高,每反应模板最小检测量分别约为12.578和1.984拷贝。用2种检测方法对75份临床样品的检测进行检测,并用普通PCR和普通RAA对每一份样品进行平行的检测,结果表明,DHAV-1和DHAV-3荧光RAA检测出的阳性样品分别为37份和34份,DHAV-1和DHAV-3样本检出率分别为49.3%(37/75)和44.5%(34/75)。均比用普通RAA法和普通PCR法检测得到的DHAV-1和DHAV-3样本检出率(分别为41.3%和36%)高,表明荧光RAA法的样本灵敏性在临床样本的检测中比普通RAA法和普通PCR法更高。综上所述,本研究完成了DHAV-3广西分离株GXBH180322株和GXBH180401株的全基因测定与分析。GXBH180322株和GXBH180401株全基因组核苷酸相似性高,但两毒株在遗传进化树中处在不同的小分支。首次成功建立了DHAV-1和DHAV-3的普通和荧光RAA检测方法。建立的方法特异、敏感,反应时间很短(均可在20分钟内完成),操作方便,适用于基层实验室检测临床样品。为DHAV-1和DHAV-3的临床检测建立了全新的、快速的、方便操作的检测方法。