中央杏仁核GABA神经元通过室旁核对小鼠情绪和摄食的调控研究

作     者：刘宁 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭菲菲

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100205[医学-精神病与精神卫生学] 10[医学] 

主      题：中央杏仁核 下丘脑室旁核 GABA 情绪 摄食 

摘      要：目的:焦虑抑郁样情绪障碍是常见的精神疾病,给患者造成很大程度的痛苦,并由于治疗存在很多副作用而效果欠佳。情绪障碍与体重减轻和食欲下降等表现也密切相关。因此,深入探讨焦虑抑郁样情绪障碍的调节机制将有助于寻找精确靶点,更有效地治疗疾病。中央杏仁核(central amygdala,Ce A)是杏仁核复合体的主要输出区域,在调节情绪状态、奖赏处理、能量平衡和摄食行为等多种生理和行为反应中发挥重要作用。Ce A内含有大量γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神经元。抑制性GABA能神经元从Ce A投射到下丘脑的室旁核(paraventricular nucleus,PVN),但与此通路调节有关的作用和机制仍不清楚。此外,核组蛋白2(NUCB2)及其加工产物nesfatin-1(NUCB2/nesfatin-1)定位于下丘脑室旁核(PVN),参与摄食的调节。因此,本研究旨在研究Ce A-PVN的GABA能神经通路并探讨该通路对小鼠情绪和摄食的调控作用及与nesfatin-1有关的潜在机制。方法:1.采用慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)建立小鼠焦虑抑郁样模型。在CRS和正常对照(normal control,NOR)小鼠的PVN注射0.3μL生理盐水(normal saline,NS)或者GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline,BIC),并据此将小鼠分为四组(n=10):NOR+NS;NOR+BIC;CRS+NS;CRS+BIC。然后通过旷场实验(open field test,OFT),高架十字迷宫(elevated cross maze,EPM),大理石掩埋实验(marble burial test,MBT)和强迫游泳(forced swimming test,FST)观察PVN内微量注射BIC对焦虑抑郁样模型小鼠行为学的影响。2.采用摄食分析法,观察PVN内微量注射BIC对CRS小鼠摄食的影响。3.采用荧光金逆行追踪结合荧光免疫组织化学法观察Ce A是否存在荧光金与GABA免疫阳性神经元的分布。4.采用化学遗传法,将腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)AAV2/9-m Dlxh M3D(Gq)-EGFP-ER2-WPRE-PA定向注射于小鼠的Ce A内用于激活GABA神经元。腹腔注射氯氮平N-氧化物(Clozapine N-oxide,CNO,0.3 mg kg-1)或NS。荧光免疫组织化学法观察两组小鼠PVN中GABAAR和c-Fos免疫阳性神经元共表达情况(n=6)。5.采用化学遗传法和行为学测试,向Ce A内注射过AAV的小鼠的PVN内注射NS或BIC,随后腹腔注射CNO(0.3 mg kg-1)或NS。小鼠被分为四组:NS(腹腔注射)+NS(PVN微量注射),NS+BIC、CNO+NS和CNO+BIC(n=10)。通过行为学实验观察Ce A-PVN的GABA能神经通路对小鼠情绪行为的影响。6.采用化学遗传法和摄食分析法,测量NS+NS、NS+BIC、CNO+NS和CNO+BIC(n=10)四组小鼠24 h摄食量。观察Ce A-PVN的GABA能神经通路对小鼠摄食量的影响。7.采用荧光免疫组织化学染色,观察PVN中GABAA受体(GABAAR)与NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元的共表达情况。结果:1.行为学结果显示,与NOR+NS组相比,CRS+NS组在旷场中心停留的时间(P0.01)和距离(P0.05)显著减少,进入高架十字迷宫开放臂的次数和时间也显著减少(P0.05),在大理石掩埋实验中小鼠埋珠数量显著增加(P0.05),在强迫游泳实验中小鼠的不动时间显著增加(P0.01);与CRS+NS组相比,CRS+BIC组在旷场中心停留的时间(P0.05)和距离(P0.05)显著增加,小鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数和时间也显著增加(P0.05),在大理石掩埋实验中小鼠掩珠数量显著减少(P0.05),在强迫游泳实验中小鼠的不动时间显著减少(P0.05)。2.摄食结果显示,与NOR+NS组相比,CRS+NS组对普通饲料6-12 h,12-24 h的摄食量显著降低(P0.01)。与CRS+NS组相比,CRS+BIC组在6-12 h,12-24h的摄食量显著增加(P0.05)。3.荧光金逆行追踪结合免疫荧光组织化学实验结果显示,小鼠一侧PVN内微量注射FG,GABA免疫荧光染色后镜下可观察到同侧Ce A内有FG标记的神经元和GABA免疫阳性神经元,且部分GABA免疫阳性细胞与FG共标记。4.荧光免疫组织化学结果显示,与NS组相比,CNO组激活Ce A内的GABA神经元后PVN处的c-Fos与GABAAR阳性神经元的共表达显著减少(P0.05)。5.化学遗传法和行为学测试结果显示,与NS+NS组相比,CNO+NS组在旷场中心停留的时间(P0.05)和距离(P0.05)显著减少,进入高架十字迷宫开放臂的次数和时间也显著减少(P0.05),在大理石掩埋实验中小鼠埋珠数量显著增加(P0.05),在强迫游泳实验中小鼠的不动时间显著增加(P0.01);与CNO+NS组相比,CNO+BIC组在旷场中心停留的时间(P0.05)和距离明显增加(P0.05),小鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数和时间也显著增加(P0.05),在大理石掩埋实验中小鼠埋珠数量显著减少(P0.05),在强迫游泳实验中小鼠的不动时间显著减少(P0.05)。6.摄食结果显示,与NS+NS组相比,CNO+NS组对普通饲料6-12 h,12-24 h的摄食量显著降低(P0.01)。与CNO+NS组相比,CNO+BIC组在6-12 h,12-24 h的摄食量显著增加(P0.05)。7.荧光免疫组织化学结果显示,在PVN处存在NUCB2/nesfatin-1与GABAAR的共表达。结论:PVN微量注射GABAA受体拮抗剂BIC可以改善慢性束缚应激模型小鼠的焦虑抑郁样行为并增加模型小鼠的摄食量。荧光金逆行追踪发现Ce A的GABA神经元可以投射至PVN。化学遗传法激活Ce A处的GABA神经元,小鼠PVN处的GABAAR激活减少,并出现焦虑抑郁样行为和摄食量减少,而PVN微量注射BIC可以逆转该效应。PVN内NUCB2/nesfatin-1能神经元表达GABAAR。因此,我们的研究表明Ce A-PVN的GABA能神经通路与小鼠的情绪行为和摄食调控有关,并且推测其可能通过调控PVN内nesfatin-1神经元发挥作用。