五种蚊媒黄病毒荧光定量检测方法的建立与应用

作     者：金鑫 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩小虎;梁晓华

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：黄病毒 蚊 蚊媒病毒 荧光定量RT-PCR 

摘      要：蚊(Mosquito)作为一种重要的医学昆虫,其种类繁多、分布范围广。我国从南至北几乎均有蚊类分布,全国已发现的蚊共有400余种。蚊可携带并传播多种人兽共患病病原,严重威胁人与动物的健康。近30年来以西尼罗病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒等为代表的蚊媒病毒在世界范围内广泛流行。我国每年都有乙型脑炎病毒、登革病毒的感染病例发生,还曾于新疆自治区分离到西尼罗病毒,于贵州省分离到寨卡病毒,这也反映了我国存在这几种病毒的传播风险。此外,不同蚊种所携带的病原区别较大,伊蚊主要传播登革热、黄热病,而乙型脑炎主要由库蚊传播。因此了解我国蚊种分布及蚊所携带病原情况具有重要意义。为了了解近年来我国部分地区蚊登革病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒五种黄病毒属病毒的携带情况,本研究选定登革病毒3’UTR基因、寨卡病毒E基因、乙型脑炎病毒NS1基因、黄热病毒NS5基因、西尼罗病毒E基因作为荧光定量检测所用靶基因。针对选定的靶基因,基于现有研究及序列分析比对结果,设计特异性引物及探针并构建阳性质粒参考品、假病毒阳性质控品。经反应条件优化及引物、探针的浓度筛选建立了多重荧光定量RT-PCR检测方法。经试验证明针对五种病原的多重检测方法各引物、探针之间无非特异扩增;最低检测限均不高于100copies/μL;组内、组间变异系数均低于0.5%;线性关系良好,标准曲线R均大于0.99。本研究于2020至2022年在辽宁、内蒙古、吉林、黑龙江、山西、广东、云南、上海等八省(市)自治区92个采样点采用灯诱法及人诱法采集蚊样本共计14663只。通过形态学及分子生物学方法共计鉴定出包括里海伊蚊、刺扰伊蚊、背点伊蚊、白纹伊蚊、丛林伊蚊、凶小库蚊、三带喙库蚊、迷走库蚊、淡色库蚊、库态按蚊、米赛按蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊在内的4属13种。应用已建立的多重荧光定量检测方法对所采集的蚊核酸样本进行抽样检测,共计检测471份蚊核酸样本。结果显示寨卡病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒均呈阴性,在2020年采集于云南省的白纹伊蚊中检测出1例登革病毒阳性样本,提示该地区可能存在登革热病毒感染风险。综上,该多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立为五种病毒的快速检测增加了可供选择的新方案,具有较高的应用价值。所获得的流行病学数据为我国五种病毒的防控提供了一定参考。