hAMSCs凝胶复合物联合G-CSF修复大鼠子宫内膜损伤的实验研究

作     者：周云凤 

作者单位：遵义医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖雁冰

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 08[工学] 100211[医学-妇产科学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 10[医学] 

主      题：人羊膜间充质干细胞 宫腔用交联透明质酸钠凝胶 粒细胞集落刺激因子 子宫内膜损伤 hAMSCs凝胶复合物 

摘      要：目的:探究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)凝胶复合物联合粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)对大鼠子宫内膜损伤的修复作用,为临床治疗中重度及重复IUA提供新思路。方法:(1)hAMSCs凝胶复合物的构建:利用酶消法从人羊膜中提取和纯化hAMSCs,传代并冻存获得P3代hAMSCs,并对P3代的hAMSCs进行细胞形态观察,同时采用细胞免疫荧光、流式细胞术对传代获得的hAMSCs进行鉴定。将hAMSCs与AHA-gel混合后进行培养,通过CCK-8法评估AHA-gel对hAMSCs的安全性。(2)大鼠子宫内膜损伤模型的建立与鉴定:选择12只8-9周龄且动情周期正常的雌性SD大鼠作为本实验的实验动物,利用宫腔注射95%乙醇来构建EI模型。将SD大鼠随机分为两组:对照组(n=6):仅行开关腹,不予任何处理;模型组(n=6):向宫腔注射95%乙醇90s。建模第7天处死大鼠收集子宫标本。观察子宫形态,进行HE染色观察子宫内膜形态学的变化,并进行子宫内膜厚度测量及腺体计数。进行Masson染色观察子宫内膜的纤维化程度,并分析两组大鼠子宫内模组织的纤维化面积比。从而评估大鼠子宫内膜损伤模型是否建立成功。(3)观察hAMSCs凝胶复合物联合G-CSF修复大鼠子宫内膜损伤的治疗效果:选择30只8-9周龄且动情周期正常的雌性SD大鼠作为本实验的实验动物,利用宫腔注射95%乙醇来构建EI模型,将大鼠随机地分为五组:对照组(n=6);模型组(n=6);G-CSF组(n=6);hAMSCs凝胶组(n=6);hAMSCs凝胶+G-CSF组(n=6)。建模第7天分别将G-CSF、hAMSCs凝胶及hAMSCs凝胶+G-CSF注入宫腔,移植治疗第14天,处死大鼠收集标本。通过HE染色观察各组子宫内膜形态学的改变,并进行子宫内膜厚度测量及腺体计数。通过Masson染色来观察各组大鼠子宫内膜的纤维化程度,并分析各组大鼠子宫内膜组织的纤维化面积比。通过免疫组化方法检测子宫内膜组织中CK-19、VEGF、整合素β3的蛋白表达。结果:(1)原代hAMSCs呈长梭形贴壁生长,传代3次后,hAMSCs细胞形态均一,大部分呈长梭形,呈现出漩涡状贴壁生长。免疫荧光检测显示hAMSCs的Vim表达阳性,CK-19表达阴性。流式细胞仪分析显示:P3代的hAMSCs中高表达CD29、CD44、CD105,低表达CD34、CD45及HLA。同时hAMSCs在AHA-gel中保持着良好的生存能力,按照细胞毒性分级分为1级。(2)大鼠子宫内膜损伤模型的建立与鉴定:子宫标本观察:对照组的子宫状态好,模型组右侧子宫近卵巢端膨大有宫腔积液,同时可观察到局部发白或有充血点。HE染色发现:与对照组相比,模型组的子宫腔失去正常结构,子宫内膜明显变薄(P0.05);hAMSCs凝胶组(P0.05)及hAMSCs凝胶+G-CSF组(P0.001)的子宫内膜厚度均明显增加。各治疗组与对照组相比,G-CSF组(P0.001)、hAMSCs凝胶组(P0.001)及hAMSCs凝胶+G-CSF组(P0.05)的子宫内膜厚度均明显变薄。子宫内膜腺体计数:各治疗组与模型组相比,G-CSF组(P0.05)、hAMSCs凝胶组(P0.001)、hAMSCs凝胶+G-CSF组(P0.001)的子宫内膜腺体个数均明显增多。各治疗组与对照组相比,G-CSF组(P0.001)、hAMSCs凝胶组(P0.001)、hAMSCs凝胶+G-CSF组(P0.05)的子宫内膜腺体个数均明显减少。Masson染色发现:对照组的子宫内膜见少量蓝色胶原纤维。模型组的子宫内膜见大量的蓝色胶原纤维,排列紧密。各治疗组的子宫内膜胶原纤维均不同程度的减少。子宫内膜纤维化面积比分析:各治疗组与模型组相比,G-CSF组(P0.001)、hAMSCs凝胶组(P0.0