应用海藻酸钠建立猪卵母细胞体外成熟的三维培养方法

作     者：邱鹏 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：石德顺;罗婵

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：3D培养 海藻酸钠 体外成熟 胚胎发育 氧化应激 

摘      要：卵母细胞的成熟质量与胚胎发育潜能直接相关,因此卵母细胞体外成熟(In vitro Maturation,IVM)是所有胚胎生产技术的基础。卵母细胞需要其周围的卵丘细胞通过细胞间联结为其提供营养支持,但目前的常规体外成熟方法不能有效维持卵母细胞和卵丘细胞间的联结,直接影响卵母细胞的成熟质量。三维培养技术能模拟细胞之间及细胞外基质信号传导的微环境,维持培养细胞之间的三维空间结构。因此,本研究拟探讨3种3D培养方法(悬滴培养法,Matrigel包埋法以及海藻酸钠水凝胶包埋法)对卵母细胞体外成熟的影响,并在此基础上选择一种方法进行优化,以期建立一种适用于猪卵母细胞IVM的三维培养技术体系,提高卵母细胞体外成熟效果。本研究取得的主要结果如下:(1)不同3D培养方式对猪卵母细胞体外成熟的影响比较了海藻酸钠水凝胶包埋法、悬滴培养法、基质胶包埋法与常规培养法对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,3D培养可以避免卵母细胞成熟过程中的贴壁现象,基质胶与海藻酸钠包埋后的卵母细胞成熟后卵丘不会出现脱落现象,且卵丘扩展规整。此外,海藻酸钠水凝胶包埋组与基质胶包埋组中的卵母细胞GVBD发生率和第一极体排出率显著高于常规培养组。3D组的线粒体均匀分布比例显著高于常规培养组,其中海藻酸钠水凝胶包埋组与基质胶包埋组的线粒体含量高于常规培养组,且卵母细胞成熟后的孤雌激活囊胚率高于常规培养组。(2)海藻酸钠凝胶包埋-解交联体系的优化分别对海藻酸钠水凝胶交联时间、解交联时间、凝胶介质等参数进行了优化。结果发现,交联时间达到5 min以上时,凝胶方可在44 h内保持稳定。0.25%(W/V)浓度下的海藻酸钠凝胶的降解率、孔隙率、吸水率、溶胀率显著高于其他实验组。解交联时间在5 min时细胞毒性显著低于其他试验组,在2 min与5 min时的囊胚率显著高于12 min组;PM液,PBS为介质配的海藻酸钠凝胶的成熟率与囊胚率显著高于三蒸水组。(3)优化后的海藻酸钠水凝胶培养体系的猪卵母细胞IVM效果在优化后的海藻酸钠水凝胶体系中成熟培养的卵母细胞,其第一极体排出率升高(75.6%vs 65.2%),死亡率下降(21.3%vs 26.7%),皮质颗粒含量与外周分布的卵母细胞比例显著升高,MⅡ期卵母细胞纺锤体分布异常现象显著降低,线粒体含量与线粒体膜电位显著升高,ROS水平显著降低。此外,卵母细胞成熟后的孤雌激活卵裂率(74.2%vs 67.3%)和囊胚率也显著提高(23.5%vs 16.5%)。上述研究结果表明,采用海藻酸钠水凝胶建立的3D成熟培养方法可以提高卵母细胞的体外成熟率及其孤雌激活后的胚胎发育率,降低氧化应激,促进卵母细胞核与细胞质同步成熟,提高IVM卵母细胞的核质成熟率。