松材线虫一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的cDNA克隆及功能研究
作者单位：青岛大学
学位级别：硕士
导师姓名：李荣贵
授予年度：2023年
主 题：松材线虫 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 RNA干扰 发育 致病力
摘 要：松材线虫病(Pine wilt desease,PWD)是由松材线虫(Pine wood nematode,PWN)感染引起的一种松林病害,短时间内便可导致松树死亡,在全球范围内造成了巨大的生态和经济损失。PWD具有传播速度快、传播媒介广泛、致死率高、防治困难等特点。目前对于PWD的防控手段主要包括物理手段、生物手段和化学手段,其中向患病松树内注射杀线剂是最有效的防治手段之一;由于药物作用靶点单一,长期使用导致松材线虫的耐药性增强,防治效果减弱,同时大量化学药物的使用对环境造成了破坏,因此,寻找杀松材线虫有效的作用靶点,开发特异性杀线药物对于PWD的防控至关重要。在本实验室前期的研究中发现,甲吡唑是一种松材线虫醇脱氢酶的特异性抑制剂,低浓度的甲吡唑对松材线虫的生命力具有显著的抑制效果,通过对低浓度甲吡唑处理松材线虫的转录组数据分析筛选出了一个显著下调差异表达基因—丝氨酸苏氨酸蛋白激酶基因(serine/threonine protein kinase gene,stk)。经生物信息学分析,stk全序列长为5087 bp,包含11个外显子和10个内含子,5’端有一段长约600 bp的非编码区;stk编码序列长为2787 bp,编码928个氨基酸残基。该基因编码的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,STK)相对分子质量为103 k Da,理论等电点为8.7,没有信号肽和跨膜区,亲水性氨基酸的比例高于疏水性氨基酸,疏水性较低。三级结构预测结果显示,STK为四聚体,每个亚基含有41个α-螺旋、14个β-折叠以及54个无规则卷曲,其中α-螺旋主要集中于C端,β-折叠主要集中于N端。在本研究中,提取了松材线虫的总RNA,并通过反转录获得了cDNA,以cDNA为模板通过PCR扩增得到了松材线虫stk的DNA片段,将其连接至克隆载体pEASY-T1,并进行了测序分析。结果显示,扩增的DNA片段全长2787bp,与stk编码序列相似性为100%。将松材线虫stk与表达载体pET-15b进行连接构建重组表达载体pET-15b-stk,将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)Rosetta(DE3)构建工程菌;使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)成功诱导了重组STK在工程菌中的表达,SDS-PAGE分析表明,重组STK主要以包涵体的形式存在,分子量约为105 k Da。探索了包涵体溶解及复性条件,将复性后的包涵体蛋白利用Ni螯合树脂进行了纯化,SDS-PAGE结果显示,重组STK纯度得到大幅度提高。对重组STK进行酶学性质分析,结果表明其最适反应p H为8.5,最适反应温度为35C,动力学参数V为11.27 U·mg·min,K值为57.50μg·m L。利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)降低松材线虫体内stk的表达水平研究了stk在松材线虫中的生物学功能。结果表明,降低松材线虫stk表达水平后,松材线虫对灰葡萄孢的取食能力显著降低;与对照组相比繁殖能力下降了62.75%;松材线虫在RNAi处理后第12 h,产卵数和卵的孵化率比空白对照组分别降低了68.28%和77.09%;stk在松材线虫幼虫和胚胎发育中发挥着重要作用:与空白对照组相比,RNAi组J2幼虫发育成为J3期和J4期的比例分别下降了65.64%和82.86%;RNAi处理48 h后,对照组松材线虫卵全部孵化,而此时实验组尚有37.76%的卵未孵化,其中63.29%的卵发育停滞在胚胎前期的细胞增殖期。进一步研究发现,RNAi组松材线虫的寿命比对照组松材线虫降低了32.71%。最后,通过2年生黑松幼苗侵染实验研究了stk对松材线虫的致病力的影响,发现在接种松材线虫后第60天,对照组黑松幼苗的针叶已经出现明显的萎蔫症状,而RNAi组黑松针叶并未出现任何萎蔫的现象;在接种后第90天,对照组黑松幼苗针叶全部萎蔫枯死,而RNAi组黑松幼苗仍未出现明显的萎蔫症状,RNAi组松材线虫的致病力显著下降。综合上述结果推测,松材线虫stk可能通过调节松材线虫的繁殖以及发育而对松材线虫的致病力产生重要影响。本课题对松材线虫致病机理的研究具有参考价值,为开发新型特异性杀线药物制剂提供了潜在的药物靶点。
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