石榴皮鞣素抑制乳腺癌相关骨溶解的机制研究

作     者：李涛 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧阳正晓

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：石榴皮鞣素 破骨细胞 NF-κB 骨溶解 乳腺癌骨转移 

摘      要：目的:骨骼是乳腺癌最常见的转移部位之一,骨转移引起的后果包括骨痛,高钙血症,病理性骨折和脊髓压迫等骨相关事件(skeletalrelated events,SREs),这些并发症可能导致患者的生活质量严重下降。破骨细胞,是目前人体内所发现的唯一骨吸收细胞,它在乳腺癌细胞分泌的细胞因子的作用下过度激活并导致骨溶解。在骨破坏后,骨基质内会释放出多种生长因子,这些因子反过来又会促进乳腺癌细胞的生长,最终导致肿瘤骨破坏-肿瘤生长的“恶性循环(Vicious circle)。因此,破骨细胞是该病理过程的关键靶点。然而,临床上用于抑制破骨细胞的主流药物仍存在副作用或可能导致严重的不良反应。近年来药理学研究发现中药单体石榴皮鞣素(Punicalin,PNC)不仅有着抗癌作用,而且可以抑制一些细胞信号通路的激活,同时这些信号通路也是破骨细胞分化过程中的关键通路。基于以上,本课题以探究PNC对于体内外破骨细胞分化的影响为出发点,研究PNC对于乳腺癌相关骨溶解的作用,以期为治疗乳腺癌骨转移提供新思路。方法:1.通过细胞计数实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)了解PNC对于骨髓单核巨噬细胞(Bone marrow monocyte/macrophages,BMMs)、原代脾细胞(Splenocytes)和RAW 264.7等细胞的细胞增殖毒性;通过核因子kappa B受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear FactorκB Ligand,RANKL)诱导破骨细胞形成、骨吸收和肌动蛋白环形成实验(F-acting)等体外实验,探究无细胞增殖毒性浓度下的PNC对于破骨细胞的分化、功能和肌动蛋白环结构的影响;通过Western Blot、NF-κB的荧光素酶报告基因检测、分子对接和Q-PCR等方法研究PNC抑制破骨细胞分化的机制。2.通过切除卵巢构建小鼠绝经后骨质疏松动物体内模型,探讨PNC是否能在体内预防破骨细胞过度激活所导致的骨量减少。通过小鼠心、肝、脾、肺、肾的组织学染色和血清谷丙转氨酶、心肌酶、尿素氮等指标来评估药物体内安全性。3.通过体外共培养实验,探讨PNC是否能抑制乳腺癌细胞诱导的破骨细胞形成;通过CCK-8、凋亡实验、侵袭与迁移实验探究PNC对于乳腺癌细胞的影响。4.通过构建裸鼠乳腺癌骨转移模型,探讨与验证PNC对于乳腺癌诱导的骨溶解的影响及其作用机制。结果:1.CCK-8实验证实,PNC在125μM浓度以下时,对BMMs、Splenocytes和RAW 264.7等细胞的增殖无毒性作用。破骨细胞分化、骨吸收及F-acting实验证实,PNC在无毒性的浓度下,抑制BMMs、Splenocytes和RAW 264.7等细胞向破骨细胞分化、骨吸收功能和肌动蛋白环的形成。Q-PCR实验证实,PNC在无毒性浓度下抑制了破骨细胞分化相关基因的表达。破骨细胞荧光素酶实验证实,PNC抑制了破骨细胞NF-κB荧光素酶报告基因表达。Western Blot实验证实,PNC抑制了破骨细胞NF-κB通路中IκBα的磷酸化,而对ERK、JNK、p38通路没有显著的影响。分子对接进一步提示PNC可能通过与IκBα分子中的氨基酸位点相结合来抑制IκBα的磷酸化。2.在卵巢切除骨质疏松小鼠体内实验中,Micro-CT检测证实,较假手术组(Sham组)小鼠而言,安慰剂组(Vehicle组)绝经后骨质疏松小鼠胫骨的骨量少,而用药组(PNC组)与安慰剂组相比,骨量较多。与假手术组(Sham组)小鼠胫骨相比,安慰剂组(Vehicle组)小鼠胫骨的骨小梁数(Tb.N)、骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨量/组织量(BV/TV)这4组骨保护指标值较低。而与安慰剂组(Vehicle组)相比,在加入PNC干预后,这4组骨保护指标均出现增加。在骨小梁间距(Tb.Sp)、骨表面积/骨量(BS/BV)这2组骨破坏指标方面,与假手术组相比,安慰剂组的值较高。而PNC干预组与安慰剂组相比,这2组骨破坏指标值较低。HE染色也进一步验证了Micro-CT的结果。TRAP染色实验证实,与假手术组相比,安慰剂组小鼠破骨细胞动员较多,而用药组与安慰剂组相比,破骨细胞动员减少。小鼠心、肝、脾、肺、肾的组织学染色和血清谷丙转氨酶、心肌酶、尿素氮等指标证实,PNC对小鼠心、肝、脾、肺、肾器官无明显毒性作用。3.体外共培养实验证实,PNC抑制了乳腺癌细胞所诱导的破骨细胞形成。CCK-8实验证实高浓度的PNC抑制了乳腺癌细胞的增殖。侵袭和迁移实验证实PNC抑制了乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。流式细胞术证实PNC增加了乳腺癌细胞凋亡的数量。4.在乳腺癌骨转移裸鼠实验中,Micro-CT检测证实,较假手术组裸鼠胫骨而言,安慰剂组荷瘤裸鼠胫骨的骨量较少。而与安慰剂组相比,PNC用药组荷瘤裸鼠胫骨的骨量较多。与安慰剂组荷瘤小鼠相比,PNC用药组荷瘤小鼠胫骨的骨保护指标Tb.N、BMD、Tb.Th和BV/TV均出现增加。在骨破坏指标Tb.Sp和BS/BV方面,与安慰剂组荷瘤小鼠相比,PNC用药组的这2组值显著降低。HE染色证实,安慰剂组中荷瘤小鼠胫骨的骨皮质被肿瘤穿过,干骺端也受损,导致肿瘤侵入膝关节的腔内生长。而在实验组,PNC的加入保护了干骺端和皮质的完整性,阻止了肿瘤向膝关节关节腔内生长。与安慰剂组相比,PNC用药组的肿瘤面积显著减少。TRAP染色证实,与安慰剂组相比,PNC用药组的破骨细胞数量较少。结论:1.PNC可抑制RANKL诱导的破骨细胞分化与骨吸收功能,其作用机制可能是通过抑制破骨细胞中的NF-κB通路所实现。2.PNC在破骨细胞过度激活的骨质疏松模型中具有骨保护作用,且初步的药物安全性检测未发现明显毒性作用。3.PNC可抑制乳腺癌所诱导的破骨细胞形成和骨溶解,且可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并诱导其凋亡,PNC在乳腺癌骨转移模型中具有骨保护作用。图24幅,表2个,参考文献91篇