MiR-93靶向PD-L1提高奶牛妊娠免疫耐受的机制研究

作     者：杨程 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓干臻

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：奶牛 子宫内膜 IFN-τ miR-93 PD-L1 M2 

摘      要：奶牛繁殖障碍是制约奶牛养殖生产效益的关键因素之一,多发生在母体早期妊娠识别阶段,对奶业造成巨大的经济损失。妊娠早期奶牛子宫内膜需要营造免疫耐受环境以确保“同种半异体胎儿在子宫内正常发育,免疫耐受性过低会导致妊娠建立失败和胚胎死亡。因此,探索奶牛妊娠早期子宫免疫耐受机制具有重要意义。巨噬细胞作为奶牛围着床期最丰富的子宫内膜免疫细胞,其特异性的功能表型和局部免疫稳态与母胎免疫耐受密切相关,但其在奶牛母胎界面上的作用机制尚不清楚。已有研究表明,妊娠期间人蜕膜巨噬细胞会受到程序性细胞死亡受体1(PD-1)和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的调控,以帮助建立母胎免疫耐受。IFN-τ与奶牛妊娠建立相关,本实验室前期测序结果发现miR-93在IFN-τ刺激后表达显著下降,然而miR-93在免疫耐受中的作用及其与PD-L1可能的互作机制尚不明确。本实验首先以妊娠早期和未妊娠奶牛子宫组织为研究对象,探究奶牛妊娠早期子宫内膜免疫微环境以及巨噬细胞极化的变化;继而通过建立奶牛子宫内膜腔上皮细胞(b EECs)和奶牛巨噬细胞(Bo Mac)共培养模型,揭示miR-93和PD-L1的靶向关系,进一步研究IFN-τ诱导的miR-93在奶牛妊娠免疫抑制中通过靶向PD-1/AKT/m TOR通路调控Bo Mac极化的分子机制,为阐明妊娠早期奶牛子宫内膜免疫耐受机制奠定科学基础。主要研究内容与结果如下:1.妊娠早期奶牛子宫内膜呈现免疫耐受现象。免疫组化分析表明,妊娠早期奶牛子宫内膜中巨噬细胞比例显著增加,M1型巨噬细胞减少,M2型巨噬细胞增多;PD-L1和PD-1阳性表达的细胞比例均在妊娠后显著增加。WB和RT-q PCR的结果进一步证实了妊娠奶牛子宫内膜中PD-L1的表达升高。此外,RT-q PCR结果显示,与未妊娠奶牛相比,妊娠早期奶牛子宫内膜中促炎Th1型细胞因子IFN-γ表达下降,抑炎Th2型细胞因子IL-4表达升高。提示妊娠早期奶牛子宫内膜中巨噬细胞募集且呈现M2型偏倚,PD-L1和PD-1高表达,子宫内膜局部呈现免疫抑制环境。***-93靶向PD-L1调控IFN-τ诱导的免疫抑制。使用IFN-τ在b EECs构建免疫耐受模型。首先,CCK-8试验检测到b EECs活力不受IFN-τ刺激的影响。RT-q PCR结果显示,在IFN-τ浓度为10、20和50 ng/m L时,PD-L1和抑炎细胞因子的表达量呈IFN-τ剂量依赖性升高,并筛选出IFN-τ的最佳干预条件为50 ng/m L刺激24 h。根据本实验室前期测序结果,miR-93在IFN-τ处理的b EECs中显著下调。结合在奶牛妊娠早期子宫内膜组织中miR-93表达量的显著下降现象,结果提示IFN-τ诱导的免疫耐受模型构建成功,且miR-93可能在妊娠早期具有重要意义。通过生物信息软件对miR-93可能的靶基因进行预测,发现其靶点碱基与PD-L1配对。双荧光素酶报告试验发现,miR-93显著下调野生型PD-L1 3’-UTR荧光素酶活性。此外,过表达miR-93在转录和翻译水平显著下调b EECs中PD-L1的表达,从而证实PD-L1是miR-93的靶基因,且miR-93抑制PD-L1的表达。***-93通过PD-1/AKT/m TOR促进Bo Mac向M2型极化。向b EECs中转染miR-93 inhibitor并构建b EECs和Bo Mac共培养模型。流式细胞术结果表明,转染miR-93 inhibitor后M2型Bo Mac比例明显增多,M1型Bo Mac比例减少,且M2/M1比值显著增加。RT-q PCR结果发现,转染miR-93 inhibitor后IL-10和CCL17等M2型细胞因子的表达水平显著升高。WB实验证明,抑制miR-93后,Bo Mac中PD-1以及AKT/m TOR通路中主要蛋白的表达均增加。提示抑制miR-93激活了PD-1/AKT/m TOR通路,进而促进Bo Mac向M2型极化。4.阻断PD-L1抑制miR-93调控Bo Mac极化过程。向共培养模型中加入PD-L1单抗Atezolizumab以阻断PD-L1的表达。RT-q PCR试验证明,单抗处理后b EECs中PD-L1的表达量显著下调,Bo Mac中PD-1的表达量也显著下调。将Atezolizumab加入转染miR-93 inhibitor的共培养体系中,流式细胞术结果表明M2型Bo Mac比例显著减少,M1型Bo Mac比例增加。RT-q PCR证明,CCL17和CCL24等M2型细胞因子的表达也随着PD-L1单抗的加入被显著抑制,CXCL9等M1型细胞因子的表达量上升。此外,PD-1/AKT/m TOR通路中PD-1、p-AKT和p-m TOR的表达均下调。综上所述,阻断PD-L1显