阿糖胞苷通过AMPK/PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬对帕金森病模型的作用及机制研究

作     者：李兰馨 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：裴海涛;郝翠

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：阿糖胞苷 帕金森病 氧化应激 线粒体自噬 AMPK 

摘      要：选题背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)已成为发病率仅次于阿尔茨海默病第二大的神经退行性疾病。目前针对帕金森病的治疗策略旨在缓解疾病的症状特征,而不改变其潜在的多因素病理学。因此,寻求对PD进展具有多管齐下作用的治疗药物被设想为一种有效的策略。阿糖胞苷(cytarabine)在临床上主要应用于白血病的治疗。长期以来已表明,非神经毒性浓度的阿糖胞苷可防止多巴胺能神经元死亡,有望成为治疗帕金森病的潜在药物。我们推测阿糖胞苷可能对帕金森病有潜在的治疗价值。目的:利用鱼藤酮(rotenone,ROT)诱导SH-SY5Y细胞模拟构建PD体外模型,观察阿糖胞苷对ROT诱导的SH-SY5Y细胞损伤保护作用,探讨阿糖胞苷对PD的影响及其潜在作用机制。方法:(1)用不同浓度的阿糖胞苷处理SH-SY5Y细胞,刃天青法评价其对神经细胞的活性作用。(2)用不同浓度的ROT处理SH-SY5Y细胞24 h建立PD体外模型,刃天青法确定ROT的最佳作用浓度。(3)设置对照组、ROT模型组、阿糖胞苷低、中、高剂量组,刃天青法检测不同组别的细胞活力,并用显微镜观察细胞形态;YO-PRO-1/PI试剂盒评价不同组别的凋亡和坏死情况。(4)评价阿糖胞苷对ROT的诱导SH-SY5Y细胞的氧化应激状态的影响:用试剂盒测定不同组别细胞的总抗氧化能力、SOD含量、GSH含量、MDA含量和NAD/NADH比值。(5)评价阿糖胞苷对ROT诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能障碍作用的影响:Mito-Tracker Red CMXRos检测线粒体活力和线粒体形态;JC-1检测线粒体膜电位(MMP);Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒评估线粒体功能。(6)评价阿糖胞苷对ROT诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬途径作用的影响:Western blotting法测定不同组别细胞的AMPK、p-AMPK、PINK1、Parkin、VADC1和DJ-1的蛋白相对表达量。结果:(1)刃天青检测结果表明,2.5μM至80μM浓度范围的阿糖胞苷对SH-SY5Y细胞几乎无毒性作用(P0.05)。(2)20μM的ROT作用于SH-SY5Y细胞,细胞活力大约有50%,因此选用该浓度作为PD模型的最佳浓度(P0.001)。(3)刃天青结果显示,阿糖胞苷可提高ROT诱导的细胞活力(P0.001),从形态上来看,阿糖胞苷改善了ROT对SH-SY5Y细胞数目的影响和形态改变;YO-PRO-1/PI试剂盒结果显示,阿糖胞苷也改善了ROT诱导的细胞凋亡和坏死。(4)氧化应激相关试剂盒结果显示,阿糖胞苷可显著改善ROT诱导的SH-SY5Y细胞中的总抗氧化能力、SOD含量、GSH含量、NAD/NADH降低和MDA含量升高(P0.001),表明阿糖胞苷通过抗氧化应激来减轻ROT诱导的SH-SY5Y细胞损伤。(5)JC-1、Mito-Tracker Red CMXRos荧光染色结果和Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒结果显示,阿糖胞苷可显著改善ROT诱导的SH-SY5Y细胞中的MMP损耗、线粒体活力减低(P0.001)、线粒体形态改变(P0.05)和线粒体功能下降(P0.05),表明阿糖胞苷通过抑制线粒体功能障碍来减轻ROT诱导的SH-SY5Y细胞损伤。(5)Western blotting结果显示,阿糖胞苷可显著升高ROT诱导的SH-SY5Y细胞中的p-AMPK、PINK1、Parkin、DJ-1、VDAC1的蛋白含量(P0.05),而AMPK抑制剂Compound C(CC)可抑制该趋势,同时阿糖胞苷其余的保护作用也相应消减。结论:我们的研究证实阿糖胞苷对PD具有潜在的神经保护作用。它能够通过激活AMPK/PINK1/Parkin信号通路增强线粒体自噬,从而拮抗ROT诱导的氧化应激和粒体功能障碍,实现其神经保护作用。作为一种有价值的替代治疗方法,阿糖胞苷有可能在不久的将来转移到PD的临床实践进程中。