LYP530作用靶标及分子机制研究和N1016抗下咽鳞癌生物活性研究

作     者：杨顺华 

作者单位：四川大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨胜勇

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：FOXK1/2 共价抑制剂 下咽鳞癌 细胞凋亡 细胞焦亡 

摘      要：本人在攻读硕士学位期间开展了两个课题的研究:(1)LYP530作用靶标及分子机制研究。(2)N1016抗下咽鳞癌的生物活性研究。分别介绍如下:第一部分LYP530作用靶标及分子机制研究本课题组前期通过表型筛选和结构优化发现一个包含丙烯酰胺的化合物LYP530对非小细胞肺癌H1975具有良好的选择抑制活性,通过蛋白质组学研究分析发现该化合物可能通过共价方式作用于FOXK1,但其具体的作用机制尚不清楚。本课题通过蛋白水平分析验证LYP530与FOXK1第404位半胱氨酸和第439位半胱氨酸发生相互作用,并且与FOXK2第357位半胱氨酸发生相互作用。研究报道,FOXK1/2是一类广泛存在于真核生物的转录因子,在细胞增殖、存活、分化等多种生物学过程中发挥重要作用。FOXK1/2在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中异常表达,并与这些肿瘤的发生、发展和不良预后密切相关,被认为是重要的潜在治疗靶标。我们首先针对(S)-4-丙烯酰胺基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺(LYP530)设计合成了探针分子(R)-4-丙烯酰胺基-N-(1-苯基-2-(2-炔丙氧基)乙基)苯甲酰胺(LYP584),用于点击化学-pull down实验。利用原核表达系统表达包含DNA结合功能域在内的FOXK1蛋白,差示扫描荧光(DSF)实验结果表明LYP530能够使FOXK1蛋白热稳定性产生变化;分别表达FOXK1蛋白第404位和第439位半胱氨酸点突变(C404S,C439S)的蛋白,胶内荧光(In-gel Fluorescence)发现小分子与两个半胱氨酸均能发生共价结合,且与Cys404的共价结合速率更快。通过序列比对发现FOXK1和FOXK2同源性很高,FOXK1的第404位半胱氨酸位于DNA结合区域附近,与之对应地FOXK2的DNA结合口袋附近的第357位也是半胱氨酸。通过表达FOXK2的蛋白,差示扫描荧光(DSF)实验表明LYP530能够使FOXK2蛋白热稳定性产生变化;胶内荧光实验发现小分子能够与FOXK2第357位半胱氨酸发生结合。进一步我们发现LYP530能够抑制FOXK高表达细胞(Capan-1、H1792、OCI-LY-19、FaDu)的生长,同时利用pull-down实验发现LYP530衍生的探针分子在FaDu细胞中能够下拉FOXK1和FOXK2蛋白,证明小分子能够与细胞内FOXK1/2共价结合。为了进一步解释LYP530与FOXK1的相互作用,我们培养小分子与蛋白复合物晶体,首次解析出FOXK1的蛋白晶体结构。总之,该部分研究内容以本课题组前期研究为基础,通过DSF、胶内荧光和pull-down实验验证LYP530与FOXK1/2发生共价结合,并且利用结构生物学手段首次解析出FOXK1蛋白晶体结构,为后续靶向转录因子FOXK的研究奠定了基础。第二部分N1016抗下咽鳞癌生物活性研究下咽鳞状细胞癌(HSCC)在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中恶性程度较高,早期无症状且难以发现,难以及时确诊和治疗,其患者死亡率高、预后很差。目前主要的治疗选择是手术治疗、放疗和化疗,因此开发抗下咽鳞癌的药物具有重要的临床价值。在本研究中,我们针对人下咽鳞癌细胞(FaDu)表型筛选,发现化合物(R)-4-丙烯酰胺-N-(1-苯基-2-(2-炔丙氧基)乙基)苯甲酰胺(FZ 05843)能够体外抑制FaDu的增殖,其IC为726 n M,进一步对该化合物进行结构优化,获得了一个高活性的化合物(R)-4-(2-丁炔酰胺基)-N-(1-(4-氟苯基)-2-羟乙基)苯甲酰胺(N1016)。体外细胞活力(MTT)测试,N1016对FaDu细胞增殖抑制的IC为68 n M,且对其它肿瘤细胞并无明显的抑制效果,说明N1016对肿瘤细胞增殖影响具有一定的细胞选择性。克隆形成实验和Edu增殖实验表明N1016能够显著抑制FaDu的增殖;划痕实验和Transwell小室实验表明N1016能够有效抑制FaDu的迁移和侵袭。流式细胞术检测发现N1016能够诱导FaDu细胞周期阻滞在G2/M期;细胞凋亡结果表明N1016能够促进FaDu细胞凋亡;并且N1016能够导致FaDu细胞内活性氧的增加,从而诱导DNA损伤。免疫印迹实验表明N1016作用于FaDu后,使促凋亡蛋白BAX表达量增高,抗凋亡蛋白BCL-2、BCL-XL表达量降低,同时剪切型的PARP、caspase-3增高;活化的caspase-3进一步剪切焦亡执行蛋白GSDME,激活Cleaved caspase 3-GSDME依赖型细胞死亡途径,诱导FaDu细胞发生焦亡。在以下人咽鳞癌细胞(FaDu)构建的小鼠异种移植皮下瘤的试验中,N1016以25 mg/kg/d的剂量持续给药21天后能够抑制小鼠皮下瘤的生长,对皮下瘤的相对肿瘤增殖率为50%。以上结果表明,N1016可作为治疗下咽鳞癌的潜在先导化合物,值得进一步研究。综上所述,在本研究中,首先我们首次解析出FOXK1的晶体结构,验证LYP530与FOXK1和FOXK2的结合。然后针对小分子化合物N1016展开抗人下咽鳞癌细胞(FaDu)的生物活性研究,体内外实验结果表明N1016均能良好的抑制FaDu的生长,该工作为后续开发下咽鳞癌的小分子药物奠定了基础。