基于mtDNA-cGAS-STING信号通路探讨RAD51抑制对三阴性乳腺癌免疫微环境的影响

作     者：余典文 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐戎

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：三阴性乳腺癌 肿瘤免疫 RAD51 线粒体DNA cGAS-STING 

摘      要：目的:考察RAD51抑制(特异性抑制RAD51基因表达的核酸药物si RAD51及RAD51重组酶小分子抑制剂B02)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞c GAS-STING信号通路的影响及分子机制,并在体内外水平评价抑制RAD51的纳米核酸药物(si RAD51@HESSS-CH)及小分子抑制剂B02对TNBC增殖及免疫抑制性微环境的影响。方法:为探索RAD51抑制对TNBC细胞中c GAS-STING信号通路的影响及分子机制,首先选用小干扰RNA(si RAD51)处理以抑制人源TNBC细胞MDA-MB-231及鼠源TNBC细胞4T1中的RAD51基因表达,小分子抑制剂B02处理以抑制RAD51重组酶活性。采用Western blot法检测TNBC细胞的先天免疫c GAS-STING信号通路中c GAS、TBK1、IRF3、STING关键蛋白/磷酸化蛋白的水平,RT-PCR法检测信号通路下游因子IFNβ、CCL5、CXCL10、ISG15的m RNA水平。si RAD51、B02处理的4T1细胞提取全细胞及胞质部分的DNA纯化后,RT-PCR实验检测胞质部分的DNA来源。免疫荧光染色检测mt DNA与线粒体的共定位情况。mt DNA合成抑制剂二脱氧胞苷(ddc)消耗4T1细胞的mt DNA后,Western blot法检测c GAS、TBK1、IRF3、STING等关键蛋白/磷酸化蛋白的水平,RT-PCR法检测IFNβ、CCL5、CXCL10、ISG15的m RNA水平。串联质谱标记法对si RAD51处理的MDA-MB-231细胞进行蛋白质组学测序,使用GO和KEGG通路富集分析RAD51基因抑制后TNBC细胞的蛋白组学变化。为在体内水平评价RAD51抑制对TNBC肿瘤免疫微环境的影响,需实现si RNA的体内有效递送。因此我们构建了一种新型的纳米核酸药物si RAD51@HES-SS-CH,其采用基于羟乙基淀粉(HES-SS-CH)的纳米载体携载si RAD51。琼脂糖凝胶电泳法筛选纳米载体HES-SS-CH与si RNA的合适配比。马尔文激光粒度仪检测纳米颗粒的粒径、电势。CCK-8法检测纳米载体对4T1细胞的毒性情况。激光共聚焦显微镜成像观察si RNA@HES-SS-CH进入TNBC细胞的情况。Western blot法检测纳米核酸药物沉默4T1细胞中RAD51基因的效果。在小鼠乳腺接种4T1细胞,构建了小鼠TNBC原位肿瘤模型。使用小动物活体成像系统检测纳米核酸药物的体内分布情况。si RAD51@HES-SS-CH及小分子抑制剂B02连续给药后,测量肿瘤体积并Ki67免疫组化染色考察对TNBC肿瘤增殖的影响。CD8免疫组化染色考察对TNBC肿瘤免疫微环境的影响。结果:经si RAD51、B02作用可显著抑制TNBC细胞中RAD51的表达。RAD51抑制可导致TNBC细胞中的先天免疫c GAS-STING信号通路c GAS、TBK1、IRF3、STING关键蛋白/磷酸化蛋白的水平升高,下游因子IFNβ、CCL5、CXCL10、ISG15的m RNA水平升高。经si RAD51及B02处理,4T1细胞的胞质部分中核DNA(以Nuc-Tert、Nuc-HK2、Nuc-NDUFV1、Nuc-PTGER2为代表)的含量基本没有变化;而线粒体DNA(以mt-Dloop1、mt-Dloop2、mt-Dloop3、mt-ND4、mt-Cytb、mt-cox1为代表)的含量明显增加。激光共聚焦显微镜成像结果显示,经si RAD51及B02处理后,4T1细胞线粒体中的mt DNA与线粒体分离,释放入细胞质中,使胞质中的ds DNA数量显著增加。二脱氧胞苷(ddc)处理可使4T1细胞中的mt DNA耗尽,在此条件下显著降低了RAD51抑制所诱导的c GAS-STING信号通路激活水平。si RAD51处理的MDA-MB-231细胞蛋白组学分析显示上调和下调的差异蛋白质分别为148个和71个,GO分析显示si RAD51处理后病毒受体活性、线粒体释放细胞色素c的正向调控被激活,脂质代谢、离子传输过程等均受明显调控,KEGG富集分析显示Th1、Th2、Th17细胞的分化、NF-k B信号通路、抗原处理与呈递等皆受到显著影响。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,HES-SS-CH与si RNA的质量比为60:1时,si RNA被纳米载体包载的效果最佳。游离HES-SS-CH与si RNA@HES-SS-CH的纳米粒径分别为176.1nm和174.8nm,聚合物分散系数(PDI)为0.209和0.204,表面电荷为+11.8m V和-0.821m V。HES-SS-CH在0～320μg/m L范围内对4T1细胞的存活无显著影响。激光共聚焦显微镜成像结