哈维弧菌WHSS0915的分离鉴定及其对多粘菌素B耐药机制初探

作     者：马珺杨 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丛伟

授予年度：2023年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：哈维弧菌 多粘菌素 多粘菌素耐药性 mcr基因 

摘      要：哈维弧菌(Vibrio harveyi)在海洋环境中广泛存在,是引起水产动物疾病的一种重要病原菌。随着抗生素的滥用,***的耐药水平不断提高,这为治疗受感染的水产动物带来了困难。多粘菌素被称为防治革兰氏阴性菌的最后一道防线。然而,随着中国学者于2016年报道了一种由质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1,细菌多粘菌素耐药问题逐渐受到各国重视,mcr-2～mcr-10也相继被报道。本课题组从许氏平鮋中分离得到一株多重耐药*** WHSS0915,通过全基因组测序筛选得到mcr-WHSS0915基因。通过蛋白质二级结构预测、同源建模、蛋白质3D结构比较、分子克隆与原核表达探究mcr-WHSS0915是否介导细菌对多粘菌素的耐药性,主要实验内容如下:(1)从患病许氏平鮋中分离得到V,harveyi WHSS0915,对*** WHSS0915耐药性进行测定,发现*** WHSS0915对9种抗生素耐药;通过结晶紫染色、回感实验、LD50测定、接种绵羊血琼脂平板等方法对*** WHSS0915的毒力表型进行鉴定,结果显示,结晶紫染色证明*** WHSS0915具有中度生物膜形成能力,对许氏平鮋的半数致死量为4.37×108CFU/尾,不具有溶血活性。(2)对*** WHSS0915进行全基因组测序,得到其细菌完成图。使用CARD数据库对全基因组序列注释,结果表明,*** WHSS0915中存在的耐药基因可介导包括四环素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢菌素类等多种抗生素的耐药性,其中一个基因被注释为mcr-9.1,同源性为53.4%;此外,对***0915与NCBI中所公布的***基因组进行基因组分析,所纳入的9株***相互间存在4055个共有基因,其中*** WHSS0915 具有 348 个特有基因,mcr-WHSS0915 并非 ***0915的特有基因。(3)对mcr-WHSS0915基因的编码蛋白MCR-WHSS0915进行了蛋白质二级结构预测、同源建模、蛋白质3D结构比较、系统发育树构建、分子对接、分子克隆及原核表达。结果表明,MCR-WHSS0915 与 MCR-3、MCR-7、MCR-9、MCR-10较相似;mcr-WHSS0915基因在*** BL21中表达结果表明,mcr-WHSS0915基因可以将多粘菌素B对*** BL21的MIC值由8 μg/mL提升到64 μg/mL。分子对接模型表明,MCR-WHSS0915蛋白与类脂A具有良好的结合能力。本文在基因水平上初步探究了***0915对多粘菌素B的耐药形成机制。我们的结果表明,mcr-WHSS0915可介导较高水平的多粘菌素耐药。并且根据MCR-WHSS0915蛋白的一级结构、二级结构以及三级结构对MCR-WHSS0915的进化水平进行了详细阐述,为后续探索多粘菌素耐药基因的起源、开发新型靶向药物和抗生素替代品、防控海水养殖动物多重耐药病原提供参考。