桔梗皂苷D镇咳祛痰活性与机制研究

作     者：钟渊涵 

作者单位：江西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾金祥

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：桔梗皂苷D 肠道菌转化 代谢组学 网络药理学 镇咳祛痰 分子对接 

摘      要：目的:咳嗽咳痰是临床常见的两大呼吸系统疾病,中药桔梗在长期治疗咳嗽咳痰中有效且毒副作用低,桔梗皂苷D(Platycodin D,PD)是桔梗的主要活性成分。本课题组前期基于谱效关系研究发现PD与其肠道菌转化物(m PDs)具有镇咳祛痰活性,但其具体的成分活性与作用机制仍缺少验证。因此本文提出了一种将网络药理学、代谢组学和分子对接相结合的新方法,用以进一步研究验证桔梗皂苷D及m PDs的镇咳祛痰活性与作用机制,以为其后续新药开发提供参考依据。方法:(1)网络药理学研究方法:前期基于谱效关系分析筛选对镇咳和/或祛痰作用有重要贡献的6个m PDs,即:Deapio-platycodin D、3-O-β-D-glucopyranosyl platycodigenin、7-hydroxyl-3-O-β-Dglucopyranosyl platycodigenin、3-O-β-D-glucopyranosyl iso-platycodigenin、Platycodigenin和Iso-platycodigenin。其中,除Deapio-platycodin D仅对祛痰有较重要贡献、3-O-β-D-glucopyranosyl iso-platycodigenin仅对镇咳有重要贡献外,其它的成分均对镇咳祛痰具有重要贡献。首先,将之确定为研究网络药理学靶点筛选研究对象。其次,通过Pharmmapper与Swiss Target Prediction数据库对PD和m PDs分进行化合物靶点预测,使用Uniprot蛋白质数据库将化合物靶点名称进行规范。接着,以“cough和“antitussive为关键词,利用Gene Cards、OMIM、TTD等数据库检索与咳嗽相关的疾病靶点;以“sputum和“expectorant为关键词检索咳痰相关的疾病靶点。然后,将获得的活性成分靶点和咳嗽、咳痰疾病靶点分别通过Venny网站取交集,分别得到化合物-镇咳疾病交集靶点及化合物-祛痰疾病靶点。把交集靶点导入STRING数据库进行人类全基因组蛋白互作分析,得到的结果再导入Cytoscape 3.8.2软件,使用Network Analyzer功能对共有靶点进行节点度值(degree)计算,使用DAVID网站对镇咳祛痰交集靶点进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析,并利用Cytoscape 3.8.2软件构建成分-靶点-通路关系网络图。(2)镇咳祛痰药效与代谢组学研究方法:将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药、PD低、中、高剂量给药组,通过浓氨水引咳和酚红排泄实验评估PD的镇咳与祛痰药效。采用代谢组学技术分析PD对浓氨水引咳模型以及酚红排泄模型小鼠内源性代谢物的影响,分别探讨PD镇咳、祛痰的作用机制。采集小鼠肺组织样品,提取出肺组织代谢物后,采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱联用质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)对小鼠肺组织代谢物进行分析,以主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法,通过变量投影重要性值(VIP)和t检验来筛选差异代谢物,并进一步基于HMDB与METLIN数据库对与镇咳及祛痰相关的差异代谢物进行鉴定,利用Metabo Analyst平台对差异性代谢物进行KEGG通路富集分析。(3)网络药理学-代谢组学联合分析方法:分别将代谢组学中鉴定的与镇咳或祛痰相关的差异代谢物和网络药理学预测的PD及m PDs的相应镇咳与祛痰共同靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中,应用Met Scape插件构建化合物-反应-酶-基因网络,筛选出具有上游靶点的差异性代谢产物,以之作为关键代谢产物,并将相应的上游靶点作为核心靶点。应用蛋白免疫印迹(WB)技术对核心靶点进行验证。最后从RCSB PDB数据库下载核心靶点蛋白的三维结构,应用Autodock软件进行分子对接,探究核心靶点与PD及m PDs的具体结合形式及结合能,以分别阐明PD及m PDs的镇咳及祛痰作用靶点。结果:(1)网络药理学预测PD与m PDs镇咳祛痰作用靶点研究结果:共获得PD及其5个镇咳活性m PDs化合物作用靶点275个,咳嗽疾病靶点836个,化合物与咳嗽疾病靶点取交集后得到共有靶点71个。对交集靶点进行PPI分析得到排名前五的与镇咳相关的靶点为ALB、PTGS2、CASP3、SRC与EGFR。对交集靶点进行GO与KEGG富集分析,结果显示富集了个321个GO生物学过程和121条KEGG信号通路。另外,共获得PD与5个祛痰活性m PDs化合物作用靶点275个,祛痰疾病靶点977个,化合物与咳嗽疾病靶点取交集后得到共有靶点87个。对交集靶点进行PPI分析得到排名前五的与祛痰相关的靶点为ALB、EGFR、CASP3、HSP