小鼠胚外内胚层（XEN）细胞系的建立及其生物学特性分析

作     者：李剑文 

作者单位：内蒙古大学 

学位级别：硕士

导师姓名：包斯琴

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：胚外内胚层 细胞建系 转录组分析 发育潜能 信号通路 

摘      要：胚外内胚层细胞系(extraembryonic endoderm cell:XENC)来源于囊胚原始内胚层衍生出来的分化后细胞群,在小鼠E6.5原肠胚阶段发育出脏器内胚层(visceral endoderm:VE)和壁层内胚层(parietal endoderm:PE),在后续发育中参与卵黄囊的生成。本研究使用小鼠着床前3.5天囊胚,用传统的XEN建系的方法建立了XEN细胞系。同时与本实验室在先前研发出的、利用ACL培养体系(Activin A、CHIR99021、m LIF)建立出的ACL-XENC进行比较,探索其细胞特性、发育潜能,信号通路等的异同点。具体实验结果如下:1.传统方法建立的XENC形态呈上皮样,细胞系有呈上皮样扁平克隆和单个细胞形态存在,碱性磷酸酶染色呈阴性结果。免疫荧光染色和QPCR结果显示,XENC高表达内胚层基因Gata4、Gata6、Sox17。这些结果与ACL-XENC相同。同时发现FGF4和Heparin联合处理XENC能显著性地上调外胚层基因标志物Sox1、Cdx2、Nestin。***-seq分析结果显示,XENC与已发表期刊的XENC数据相比,具有高度相同组学特性。与ESC、Pr ESC在特异性基因表达上有显著性的区别。上调基因主要富集在细胞分化、细胞迁移、对化学因子刺激的应答、细胞甲基化、各细胞化学信号通路、细胞表面受体信号通路、跨膜受体酪氨酸激酶信号通路等。通路热图显示,XENC的信号转导主要集中在TGF-β信号通路、Wnt信号通路和FGF信号通路。3.体外分化实验证实,BMP4诱导XENC能显著上调VE胚层相关的基因如:Hnf4α、Afp、Cited1,显著下调PE胚层相关的基因Snai1、Sparc。EB分化实验证明XENC和ACL-XENC形成的EB具有内外胚层分化的能力。ACLXENC能够贡献到E6.5原肠胚中,但XENC不具备该嵌合能力。4.最后,探讨了不同信号通路对ACL-XENC的影响,发现ACL-XENC的存活和细胞特性维持主要依赖于TGF-β信号通路,细胞增殖和细胞形态主要依赖于Wnt/β-catenin信号通路,细胞保持未分化的状态主要依赖JAK/STAT3主导的LIF信号通路,但对于细胞自身特性的维持和细胞增殖并不是必须。综上所述,本实验获得到的传统的XENC和ACL-XENC,都具有胚外内胚层细胞的特征。在发育潜能上,ACL-XENC能贡献到E6.5原肠胚具体区域上,XENC在潜能上相对弱于ACL-XENC。这对于我们理解在化学成分明确、特定的化学小因子的培养基下建立细胞系可能更好地维持细胞自身特性提供很好的启示。