金枪鱼特定腐败菌荧光假单胞菌适冷活性抑制剂的筛选及抑制机理的研究

作     者：岑丛楠 

作者单位：浙江工商大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王彦波

授予年度：2021年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：荧光假单胞菌 适冷能力 L-苯丙氨酸 虚拟筛选 转录组学 

摘      要：金枪鱼肉品鲜美、营养价值高,是优质的海洋动物蛋白,且深受消费者喜爱。但由于其蛋白、水分含量偏高,在低温贮藏过程中极易发生腐败。低温贮藏可以适度延缓水产品中腐败微生物的生长及代谢,延长水产品的货架期。然而,以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)为代表的适冷菌能够在低温环境下继续生长繁殖,产生蛋白酶和脂肪酶引起冷藏金枪鱼腐败变质,对食用安全造成了巨大的威胁。如何寻找一种安全有效的抑制剂用于靶向调控荧光假单胞菌的适冷活性,从而降低荧光假单胞菌在金枪鱼低温贮藏过程中的致腐能力是目前研究的重点。传统的抑菌物质筛选方法具有随机性和不确定性,其效率低且成本高,需要大量的人工筛选实验。计算机辅助筛选可以通过虚拟靶点高通量筛选数据库中能与靶点相互作用的物质,筛选过程高效且经济。鉴于此,本研究以金枪鱼特定腐败菌荧光假单胞菌为研究对象,通过基因组学确定关键适冷蛋白Alg K、Csp A和调控因子Rpo S,并以此作为筛选靶点,利用同源建模、分子对接、虚拟筛选等方法,寻找适冷活性的天然抑制剂,从转录水平和分子动力学角度研究相关抑制机理,开发靶向适冷抑制剂用于延长金枪鱼低温贮藏。主要研究内容如下:(1)通过多指标测定发现,金枪鱼在4℃低温下保存7日后达到腐败,在腐败终点的鱼肉菌群分析中发现假单胞菌是占据优势菌群的菌属,通过对腐败后的鱼肉进行菌种筛选,得到了7株不同的荧光假单胞菌,通过菌株适应能力的测定,选取了适应能力与腐败能力均较强的77号菌株进行后续实验。(2)通过对77号菌株进行全基因组扫描测序并得到了其与适冷活性相关的Csp A型、Alg K型和Rpo S型蛋白的氨基酸序列。用SWISS-MODEL进行后续建模与评价,蛋白模型均结构合理且具有较好的质量。以蛋白模型为受体靶点,从HMDB的食品组分数据库中筛选抑制剂,并得到了一种对接评分较高的抑制剂L-苯丙氨酸。(3)通过检测L-苯丙氨酸对荧光假单胞菌在4℃低温下的生长表型的影响,发现其对荧光假单胞菌在低温下的生长能力、生物被膜的产生与附着、产胞外多糖的能力、蛋白酶活性的产生都具有显著的抑制效果。通过转录组学测试发现,L-苯丙氨酸的处理影响了菌膜的产生与黏附以及细菌对环境的应激反应。分子对接分析结果显示L-苯丙氨酸与三种关键的适冷蛋白的关键活性位点能发生结合,从而干扰了蛋白发挥功能。通过分子动力学的分析,发现L-苯丙氨酸能够通过氢键与亲疏水作用挤压Alg K蛋白与Rpo S蛋白的结构。