FMRP通过AKT/mTOR通路调控海马自噬对脆性X综合征的影响

作     者：张博涵 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：崔慧先;李莎

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：脆性X综合征 FMRP 自噬 AKT/mTOR通路 神经行为 

摘      要：脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是最常见的遗传性智力缺陷综合征,也是孤独症谱系障碍最常见的单基因突变疾病。FXS的主要分子机制是脆性X智力低下基因1(Fragile X mental retardation gene 1,Fmr1)沉默导致脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein,FMRP)缺失,致使其靶基因m RNA的翻译表达异常。研究表明,Fmr1基因敲除(Knockout,KO)小鼠脑内自噬途径被抑制,然而FMRP对海马神经元自噬的调控机制及在FXS病理生理过程中的作用尚不清楚。本研究将以小鼠海马神经元细胞系HT22细胞以及Fmr1 KO小鼠和同背景品系野生型(Wild-type,WT)小鼠为研究模型,联合使用分子生物学、流式细胞术、形态学和神经行为学等多种技术手段,从分子、细胞、动物多层面开展研究,旨在揭示FMRP调控自噬功能的途径并阐明海马神经元自噬功能变化在FXS病理生理过程中的作用。目的:本研究以HT22细胞和Fmr1 KO、WT小鼠为研究对象,明确FMRP缺失对自噬以及线粒体自噬的影响,阐明AKT/m TOR通路在调控海马自噬中的作用机制,并探究雷帕霉素在FXS中的治疗作用和机制。方法:第一部分FMRP对Fmr1 KO小鼠海马及HT22细胞自噬的影响1.使用免疫印迹实验,明确FMRP缺失对HT22细胞和小鼠海马自噬相关蛋白表达的影响。2.使用自噬双标腺病毒感染HT22细胞,观察Fmr1敲低对自噬流和自噬小体的影响。3.使用免疫荧光细胞化学染色,观察FMRP缺失对HT22细胞自噬相关蛋白表达和定位的影响。4.使用DCFH-DA荧光探针,探究FMRP缺失对HT22细胞内ROS表达的影响。5.使用免疫印迹实验,观察FMRP缺失对HT22细胞和小鼠海马线粒体自噬蛋白表达的影响。第二部分FMRP影响Fmr1 KO小鼠海马自噬的机制研究1.使用免疫印迹实验,明确FMRP缺失对小鼠海马AKT/m TOR通路蛋白表达的影响。2.使用免疫印迹实验,以p-m TOR表达为参考进行雷帕霉素的量效实验,明确最佳治疗剂量,按照该剂量给予小鼠雷帕霉素,检测小鼠海马自噬相关蛋白表达的变化。3.使用免疫印迹实验,观察给予WT和Fmr1 KO小鼠雷帕霉素后线粒体自噬蛋白PINK1的表达变化。4.使用透射电子显微镜,观察给予WT和Fmr1 KO小鼠雷帕霉素后海马CA1区神经元超微结构的变化。第三部分AKT/m TOR通路对Fmr1 KO小鼠神经行为的影响1.旷场实验检测雷帕霉素对WT和Fmr1 KO小鼠焦虑状态的影响。2.刻板行为检测雷帕霉素对WT和Fmr1 KO小鼠刻板行为的影响。3.三箱社交检测雷帕霉素对WT和Fmr1 KO小鼠社交能力和社交偏好能力的影响。4.新物体识别和Morris水迷宫检测雷帕霉素对WT和Fmr1 KO小鼠识别记忆能力和空间记忆能力的影响。结果:第一部分FMRP对Fmr1 KO小鼠海马及HT22细胞自噬的影响1.免疫印迹实验结果显示,HT22细胞sh-Fmr1组ULK-1磷酸化水平、p62表达高于NC组,Fmr1 KO小鼠海马ULK-1磷酸化水平、p62表达高于WT组,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低于WT组。2.自噬流检测结果显示,HT22细胞sh-Fmr1组GFP与RFP共定位系数高于NC组。3.免疫荧光细胞化学染色结果显示,与NC组相比,HT22细胞sh-Fmr1组LC3表达水平下降,p62表达水平明显上升,而LC3与TOM20共定位减少。4.使用DCFH-DA荧光探针检测ROS水平,结果显示HT22细胞sh-Fmr1组荧光强度高于NC组,ROS水平升高。5.免疫印迹实验结果显示,HT22细胞sh-Fmr1组PINK1表达低于NC组,Fmr1 KO小鼠海马PINK1表达低于WT组。第二部分FMRP影响Fmr1 KO小鼠海马自噬的机制研究1.免疫印迹实验结果显示,Fmr1 KO小鼠海马通路蛋白AKT、m TOR磷酸化水平高于WT组。2.免疫印迹实验结果显示,10 mg/kg/d的雷帕霉素使Fmr1 KO小鼠海马p-m TOR表达下降,与WT对照组水平相当,且减少了ULK-1磷酸化和p62表达水平,以及增加了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。3.免疫印迹实验结果显示,与WT Ctrl组相比,Fmr1 KO Ctrl组小鼠海马PINK1表达水平降低,Fmr1 KO Rapa组小鼠海马PINK1蛋白表达水平高于Fmr1 KO Ctrl组,而WT Rapa组与WT Ctrl组无统计学意义。4.透射电镜结果显示,WT Ctrl组和WT Rapa组中,胞质内可观察到自噬小体,其内可见待降解的线粒体;Fmr1 KO Ctrl组中,线粒体电子密度降低,线粒体内膜不连续,部分呈空泡样改变,且无线粒体自噬现象;Fmr1 KO Rapa组中,胞质内可观察到自噬小体和被包裹的线粒体结构。第三部分AKT/m TOR通路对Fmr1 KO小鼠神经行为的影响1.旷场实验结果显示,与WT Ctrl组相比,Fmr1 KO Ctrl组中央区域运动时间、运动路程和平均运动速度增加;WT Rapa组与WT Ctrl组相比,无统计学意义;Fmr1 KO Rapa组与Fmr1 KO Ctrl组相比,无统计学意义。2.刻板行为检测结果显示,Fmr1 KO Ctrl组梳毛时间高于WT Ctrl组,而梳毛次数两组无统计学差异;给予雷帕霉素后,WT和Fmr1 KO小鼠的梳毛行为显著减少。3.三箱社交结果显示,与WT Ctrl组相比,Fmr1 KO Ctrl组社交指数和社交偏好指数降低;WT Rapa组和WT Ctrl组相比,无统计学意义;而Fmr1 KO Rapa组的社交指数和社交偏好指数高于Fmr1 KO Ctrl组。4.新物体识别结果显示,与WT Ctrl组相比,Fmr1 KO Ctrl组新物体识别指数降低;WT Rapa组相比WT Ctrl组新物体偏好指数,无统计学意义;而Fmr1 KO Rapa组与Fmr1 KO Ctrl组相比,新物体识别指数提高。5.Morris水迷宫结果显示,与WT Ctrl组相比,Fmr1 KO Ctrl逃避潜伏期增加、目标象限停留时间和平台穿越次数增加,WT Rapa组逃避潜伏期增加,目标象限停留时间、平台穿越次数无统计学意义;与Fmr1 KO Ctrl组相比,Fmr1 KO Rapa组逃避潜伏期减少,目标象限停留时间增加。结论:1.FMRP缺失抑制HT22细胞和小鼠海马中的自噬途径,并损害线粒体自噬。2.FMRP缺失使小鼠海马AKT/m TOR通路过度激活,给予雷帕霉素,抑制m TOR磷酸化活化自噬,并增强线粒体自噬。3.雷帕霉素改善Fmr1 KO小鼠的刻板行为、社交能力和学习记忆能力。