BRAFV600E野生型甲状腺乳头状癌的临床病理学特征及基因表达谱研究

作     者：李栋 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王继纲

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：甲状腺乳头状癌 BRAFV600E 端粒酶逆转录酶 受体酪氨酸激酶 

摘      要：甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤,占所有甲状腺癌的85%-90%。BRAF点突变(c.1799 TA,p.V600E)是PTC中最为常见的基因变异。既往研究发现BRAF 与PTC的高侵袭性的生物学行为相关,是PTC的独立预后因素,可以作为I治疗分层系统的参考指标。但是近年来也有文献报道,BRAF突变与PTC的组织学亚型有关,与某些侵袭性的临床病理特征并不相关,不能作为独立预后因子。除BRAF外,PTC中也存在其他一些重要的基因变异,如RAS突变、RET、NTRK、ALK重排、TERT启动子突变等,这些变异基因同PTC的组织学分型以及预后存在一定相关性。迄今为止,有关BRAF野生型PTC的研究报道较少,对于这一部分病例的临床病理特征以及基因变异特点缺乏足够的认识。本研究以BRAF野生型PTC为研究对象,对其临床病理特征展开回顾性研究;通过Sanger测序检测RAS以及TERT启动子突变状态,通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测RET和ALK重排,通过免疫组化检测pan-TRK、ALK、PD-L1以及错配修复蛋白的表达,通过二代测序(next generation sequencing,NGS)对部分病例中的变异基因进行检测,对NGS发现的变异基因采用Sanger测序扩大样本量进行检测。同时,本研究将分析具有某些基因变异的PTC的病理学特点,期望为今后相关PTC的诊断和治疗提供参考。第一部分BRAF野生型甲状腺乳头状癌的临床病理学特征目的分析BRAF野生型PTC的临床病理学特征以及预后特点。方法收集2016年11月至2021年11月期间青岛大学附属医院手术切除的1564例PTC病例(为保证能切取足够的组织,仅选取最大径≥1 cm者),免疫组化染色判定BRAF状态(阴性者判定为野生型,阳性者为突变型);分析BRAF野生型PTC的临床病理特点,包括性别、年龄、病灶数目、淋巴结转移、伴发病变以及组织学分型,采用卡方检验分析BRAF野生型和突变型PTC的临床病理特征差异。结果1564例PTC病例中,1261例为BRAF突变型(80.6%),303例为BRAF野生型PTC病例(19.4%)。在303例BRAF野生型PTC病例中,男性67例,女性236例(男女比例1:3.5),年龄11～70岁(平均年龄42岁,中位年龄?与后面一致),病灶大小1～7.5cm(平均大小1.8 cm),198例有被膜侵犯(或发生于被膜下)(65.3%),207例有区域淋巴结转移(68.3%),120例伴有桥本氏甲状腺炎(39.6%),80例为多发病灶(26.4%)。在1261例BRAF突变型PTC病例中,男性298例,女性963例(男女比例1:3.2),年龄17～77岁(平均年龄44岁,中位数年龄为43岁),病灶大小1～8 cm(平均1.6 cm),900例有被膜侵犯或位于被膜下(71.4%),717例有区域淋巴结转移(56.9%),221例伴有桥本氏甲状腺炎(17.5%),411例病灶多发(32.6%)。同BRAF突变型PTC相比,BRAF野生型PTC更常伴发桥本氏甲状腺炎,区域淋巴结转移率更高。结论本研究是目前国内以BRAF野生型PTC为研究对象的样本量最大的病例对照研究之一。BRAF野生型PTC同样具有较强的侵袭转移能力,一部分病例可能与桥本氏甲状腺炎密切相关;BRAF基因状态不能作为评价PTC侵袭转移的唯一指标。第二部分BRAF野生型甲状腺乳头状癌中变异基因的检测目的研究BRAF野生型PTC中存在的变异基因。方法选取118例BRAF野生型PTC病例同时进行免疫组化及ARMS-PCR检测为无BRAF突变的PTC病例进行详细分析。其中99例采用Sanger测序检测KRAS、NRAS、HRAS的2号外显子的12/13密码子以及3号外显子的61密码子、检测TERT启动子突变(c.-146 CT和c.-124 CT);采用FISH检测RET和ALK基因易位;采用免疫组化检测ALK(D5F3)、pan-TRK、PD-L1(22C3)、MLH1、PMS2、MSH2、MSH6等指标。对于某些特殊组织学类型,免疫组化pan-TRK和ALK阳性,或者提取的基因组DNA质量较好的PTC病例,进一步进行NGS检测(其中15例采用诺禾致源的ALL-IN-ONE cancer gene panel,9例采用北京元码的甲状腺癌18基因panel),对检测到的点突变再次采用Sanger测序在其他病例中进行检测。结果本组118例PTC中,经典型74例、浸润性滤泡型37例、弥漫硬化型4例,其他特殊类型3例;某些形态学特点提示可能为BRAF野生型PTC。104例PTC有4～67个月的随访记录,其中10例出现术后复发转移(9.6%)。Sanger测序发现7例存在TERT启动子突变(均为c.-124 CT,7.1%,7/99),所有病例中均未检测到RAS突变。FISH检测出RET基因重排10例(12.5%,10/80,另外19例无法判读),所有病例中均未检测到ALK重排。免疫组化染色检测出ALK阳性1例(1.0%,1/99),pan-TRK阳性6例(6.1%,6/99),PD-L1阳性6例(6.1%,6/99,其中只有1例弥漫阳性),而所有病例均未发现微卫星不稳定。NGS结果发现1例PTC存在NIN无义突变,1例同时存在CHIC2、KAT6B、AXIN1错义突变,1例同时存在LPHN3错义突变和DOCK8移码突变,Sanger测序证明这些突变未出现于其他病例中。此外,3例存在RET重排(FISH检测阳性,均为CCDC6::RET融合),1例存在NTRK1重排(TPM3::NTRK1融合),1例存在ALK点突变(c.2919GA以及c.3541CT)。6例pan-TRK免疫组化阳性的病例中,有5例行NGS检测,其中4例未检测到NTRK1/2/3相关变异。结论浸润性滤泡型PTC、经典型PTC缺乏间质或伴有大量的滤泡结构、伴有明显的桥本氏甲状腺炎提示可能为BRAF野生型PTC;RET重排和TERT启动子突变在BRAF野生型PTC中相对常见,RAS以及其他基因的变异相对少见;BRAF免疫组化和ALK免疫组化染色同基因检测结果一致,pan-TRK的免疫组化染色与测序结果符合率较低。第三部分受体酪氨酸激酶易位的甲状腺乳头状癌的临床病理学特征目的研究受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)易位的PTC的临床病理学特征。方法详细分析第二部分中经NGS检测以及在我院病理科进行NGS检测证实的具有RTK基因易位的9例BRAF野生型PTC,其中4例RET重排,3例ALK重排,2例NTRK1重排,总结其临床病理特点。结果本组病例中2例为弥漫硬化型,5例为经典型(其中1例伴高级别分化型甲状腺癌,1例伴未分化癌),2例为浸润性滤泡型(1例伴高级别分化型甲状腺癌);RTK易位的PTC常表现出高侵袭性的组织学特点:弥漫硬化型、脉管侵犯、腺内播散、肿瘤性坏死、复杂的筛状结构、颈部淋巴结的转移。手术时有2例已出现肺转移;3～53个月的随访期内,有3例出现新发病灶或原病灶持续进展。结论RTK基因易位PTC通常具有较强的侵袭转移能力。