反义RNA广谱抑制冠状病毒及生物活性肽增敏研究

作     者：信强 

作者单位：内蒙古医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苏秀兰

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：保守反义RNA 广谱抑制 冠状病毒 新冠病毒 生物活性肽 

摘      要：目的:引起新冠肺炎、SARS和MERS等的冠状病毒及其变异株,严重侵害人类生命健康和经济社会发展。迫切需要研发广谱抗冠状病毒药,有效抗新冠病毒及其变异株,以及治疗已知和新生冠状病毒引起的严重疾病。目前国内外尚无可广谱抑制冠状病毒的保守反义RNA的论文报道。本论文探究了反义RNA广谱抑制冠状病毒及生物活性肽增敏的作用。方法:(1)冠状病毒全基因组超算分析和RDRP基因比对探索五十个保守区和保守序列。(2)构建八种感染人的冠状病毒的RDRP-EGFP融合基因表达质粒。(3)细胞培养与RDRP冠状病毒保守区基因、反义RNA(5-1)表达载体、反义RNA(6-1)表达载体的慢病毒感染和转染。(4)将5条反义RNA序列整合到一个表达载体中串联表达,将6条反义RNA序列整合到一个表达载体中串联表达,分别通过荧光定量RT-QPCR和流式细胞术,检测反义RNA(5-1)、反义RNA(6-1)对八种感染人的冠状病毒RDRP基因表达的抑制效果,并检测对八种感染人的冠状病毒RDRP蛋白质表达的抑制效果。(5)体外培养293T细胞,常规细胞转染,流式细胞术分析。结果:相对阴性对照(SH1),流式细胞术及实时荧光定量RT-QPCR分析结果显示:(1)5个反义RNA串联表达(5-1)对八种感染人的冠状病毒RDRP蛋白质和RNA表达的抑制率分别达到52.96%-76.41%及0.00%-98.57%;(2)6个反义RNA串联表达(6-1),具有较好地抑制八种感染人的冠状病毒RDRP的蛋白质和RNA表达,分别达到53.45%-76.53%以及0.00%-87.91%;(3)5个反义RNA串联表达(5-1),转染前30min加20uL生物活性肽,可以平均抑制2019-nCoV冠状病毒RDRP的蛋白质表达的46.78%。(4)RT-QPCR结果分析表明,5个反义RNA串联表达(5-1),转染前30min加20uL生物活性肽,可以平均抑制2019-nCoV冠状病毒RDRP的RNA表达的87.39%。结论:(1)串联表达的五个保守反义RNA和串联表达的六个保守反义RNA显著高效抑制新冠病毒及其变异株,显著高效广谱抑制所有已知八种感染人类的冠状病毒,对治疗冠状病毒及其变异株和未来新生的高致病性冠状病毒引起的疾病,有重大理论和现实意义,可用于研发广谱抗冠状病毒药,有较好的应用前景。(2)生物活性肽具有一定的增强对反义RNA高效抑制新冠病毒RDRP的增敏作用,具有深入研究价值。