山羊多羔性状相关基因WNT4可变剪接体鉴定及功能分析

作     者：王鹏 

作者单位：河北工程大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘玉芳

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：云上黑山羊 颗粒细胞增殖 可变剪接 WNT4 SRSF6 

摘      要：WNT家族成员4(Wnt family member 4,WNT4)是WNT蛋白家族重要成员之一,参与多种细胞的生长和分化,在胚胎发育和维持细胞稳态过程中起重要作用。研究发现山羊中存在WNT4可变剪接,但WNT4可变剪接在山羊卵巢中的表达及作用机制尚未报道。本研究从高产组(平均产羔数为3.00±0.38/只)和低产组(平均产羔数为1.32±0.19/只)2个群体中分别挑选5只处于卵泡期和5只处于黄体期的云上黑山羊,共20只。屠宰并收集山羊卵巢等组织用于后续试验。本研究对云上黑山羊群体中的WNT4可变剪接体进行鉴定;通过体外培养山羊颗粒细胞,过表达/干扰WNT4不同可变剪接体,解析WNT4可变剪接体对颗粒细胞增殖的分子机制。主要研究结果如下:1.在云上黑山羊卵巢组织中成功克隆出WNT4的2个可变剪接体WNT4-α和WNT4-β。结果表明,WNT4-α和WNT4-β的CDS区全长分别为1055 bp和986 bp,编码350和317个氨基酸;蛋白质二级结构和三级结构预测表明,WNT4-β与WNT4-α相比蛋白质结构发生了改变,WNT4-α的三级结构更稳定;在高产云上黑山羊卵巢中WNT4-α和WNT4-β的表达水平均显著高于低产云上黑山羊(P0.05);在高产云上黑山羊卵泡期卵巢中WNT4-α的表达水平显著高于WNT4-β(P0.05)。2.为研究WNT4不同剪接体对山羊颗粒细胞增殖的影响。免疫荧光(IF)结果显示,WNT4蛋白在山羊颗粒细胞中高度表达,且WNT4-α的表达水平显著高于WNT4-β(P0.05);在山羊颗粒细胞中分别过表达/干扰WNT4-α和WNT4-β,结果显示过表达WNT4-α和WNT4-β均能够显著增加细胞增殖标志基因重组人细胞周期蛋白D2和重组人细胞周期蛋白依赖激酶4的表达(P0.05);WNT4-α和WNT4-β均显著促进颗粒细胞增殖(P0.05);显著促进雌二醇和孕酮的分泌(P0.05)。WNT4的2个可变剪接体WNT4-α和WNT4-β对山羊颗粒细胞增殖均起促进作用,且WNT4-α产生的作用显著高于WNT4-β(P0.05)。在山羊颗粒细胞过表达/干扰WNT4后检测了WNT信号通路标记基因RAC家族小型GTP酶与RAS同系物家族成员A的m RNA表达及关键信号因子β-catenin的蛋白水平。结果表明,过表达WNT4后WNT信号通路相关的RAC1与RHOA基因表达量和关键因子β-连环蛋白水平显著升高(P0.05)。表明WNT4可通过WNT/β-catenin信号通路调控山羊颗粒细胞增殖。3.探究富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子6在WNT4可变剪接产生过程中的作用和对颗粒细胞增殖的影响。本试验发现SRSF6的表达水平显著高于其他剪接因子(P0.05);SRSF6和WNT4野生型载体共转染后荧光素酶活性显著升高(P0.05),表明SRSF6可与其发生结合。过表达SRSF6后,WNT4-α可变剪接体的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05),WNT4-β可变剪接体的m RNA和蛋白表达水平显著升高(P0.05),细胞增殖标志因子CCND2与CDK4基因的表达水平显著下降(P0.05),显著抑制颗粒细胞增殖(P0.05)。表明SRSF6剪接因子能够调控WNT4可变剪接的产生,并对颗粒细胞增殖起抑制作用。综上,本研究在云上黑山羊群体中鉴定出WNT4有2个可变剪接体,并对WNT4不同可变剪接体对颗粒细胞的影响及可变剪接产生的机制进行了探究。本研究为深入解析WNT4调控山羊颗粒细胞增殖的潜在分子机制提供理论基础。