金猫解毒方对肝星状细胞诱导的髓源性抑制细胞募集和分化的影响及机制探究

作     者：聂姝常 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程彬彬

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：肝星状细胞 髓源性抑制细胞 CXCL2/CXCR2 肿瘤微环境 肝纤维化 金猫解毒方 

摘      要：研究背景原发性肝癌与肝纤维化/肝硬化密切相关,肝星状细胞(HSCs)的活化与增殖是肝纤维化/肝硬化形成的中心环节。髓源性抑制细胞(MDSCs)通过多种机制在肿瘤微环境(TME)中显示出强大的免疫抑制和促肿瘤功能。HSCs是肝脏特有的基质细胞,不仅是肝纤维化/肝硬化发生发展的关键,在HCC发生发展过程中同样发挥至关重要的作用。同时,激活后的HSCs还能通过募集MDSCs发挥免疫调节作用。我院中医肿瘤科基于数十年临床经验拟定了“金猫解毒方(JDF),并在长期的临床应用中证明了其疗效。然而其作用机制尚未完全阐明。研究目的探究金猫解毒方对肝星状细胞诱导的MDSCs的募集和分化的影响及其机制,从而为金猫解毒方通过调节肿瘤微环境发挥其抗肝癌作用提供理论基础。研究方法1.成年雄性C57小鼠(20±2 g)腹腔注射DMN 5 mg/kg制备肝硬化模型,4周后制备肝脏原位移植瘤,造模后JDF组给予金猫解毒方灌胃(12.74 g/kg·天),灌胃2周后处死动物,免疫组化观察肝组织中α-SMA的表达,免疫荧光观察肿瘤组织中CD11b+Gr1+MDSCs的细胞数量及分布。2.提取小鼠骨髓和脾脏原代细胞,用TGF-β(10 ng/ml)单独或联合JDF(1mg/ml)干预小鼠肝星状细胞JS1,获得不同处理的肝星状细胞条件培养基(HSC-CM)。采用HSC-CM干预骨髓或脾脏原代细胞5天,流式细胞术、PCR技术观察JDF体外对肝星状细胞诱导的MDSCs分化以及细胞因子分泌的影响。提取小鼠脾脏原代细胞,磁珠法分选小鼠脾脏细胞中CD11b+Gr1+细胞,并将其铺于Transwell上室,下室中加入不同处理的HSC-CM,6小时后流式细胞术计数迁移细胞数量。3.通过细胞因子芯片检测活化的肝星状细胞(a HSC)上清中过表达的细胞因子;进一步使用荧光定量RT-PCR进行验证,明确JDF对a HSC过表达的细胞因子的作用。4.提取小鼠脾脏原代细胞,用CXCL2(5 ng/ml)、HSC-CM、SB225002(10μM)单独或联合干预5天,通过流式细胞术检测CD11b+Gr1+细胞比例;采用Transwell小室检测上述干预方法对MDSCs迁移的影响,用流式细胞术计数迁移数量。5.提取小鼠脾脏原代细胞,用CXCL2(5 ng/ml)、JDF(1 mg/ml)共同干预5天,通过流式细胞术检测CD11b+Gr1+细胞比例;采用Transwell小室检测上述干预方法对MDSCs迁移的影响,用流式细胞术计数迁移数量。6.提取小鼠脾脏原代细胞,用a HSC-CM和SB225002(10μM)、JDF(1 mg/ml)预处理60 min,CXCL2(5 ng/ml)处理60 min,Western blot检测p-ERK和p-AKT的水平。研究结果1.在肝脏原位移植瘤小鼠模型中,与对照组相比,DMN组α-SMA表达显著增加,而JDF组肝组织α-SMA表达较DMN组显著减少。与对照组相比,DMN组小鼠肿瘤组织中CD11b+GR1+双染细胞数量显著增加;而JDF组肿瘤组织中CD11b+GR1+双染的细胞个数较DMN组显著减少。2.与对照组相比,a HSC-CM诱导小鼠骨髓原代细胞CD11b+Gr1+MDSCs的比例显著增加(P0.05);而JDF组CD11b+Gr1+MDSCs分化的比例显著低于a HSC-CM组(P0.01)。与对照组相比,a HSC-CM处理后小鼠脾脏原代细胞CD11b+Gr1+MDSCs的比例也显著增加(P0.001);JDF组CD11b+Gr1+MDSCs的比例显著低于a HSC-CM组(P0.001)。Transwell小室结果显示,JDF组诱导CD11b+Gr1+MDSCs迁移的数目显著低于a HSC-CM组(P0.05)。另外,与a HSC-CM组相比,JDF组MDSCs的Arg-1和IL-10的m RNA表达水平明显降低(P0.05)。3.细胞因子芯片检测发现,a HSC分泌的细胞因子中,CXCL2的上升倍数最高。荧光定量RT-PCR发现,a HSC细胞中m RNA表达水平较对照组显著升高(P0.01);JDF组与a HSC组相比,CXCL2 m RNA表达水平明显降低(P0.01)。4.与对照组相比,CXCL2处理后小鼠骨髓原代细胞CD11b+Gr1+MDSCs比例明显增加(P0.001),与CXCL2组相比,SB225002组CD11b+Gr1+MDSCs的比例明显降低(P0.01),且MDSCs迁移的数量明显减少(P0.01)。5.与HSC-CM组相比,HSC-CM+SB225002组CD11b+Gr1+MDSCs的比例明显降低(P0.001),同时HSC-CM+SB225002组较HSC-CM组MDSCs迁移的数量明显降低(P0.001),提示阻断CXCL2-CXCR2通路对于a HSC诱导的MDSCs募集及分化有抑制作用。与CXCL2组相比,JDF组小鼠骨髓原代细胞向CD11b+Gr1+MDSCs分化比例明显降低(P0.001),及其MDSCs的迁移数量也明显降低(P0.01)。6.WB结果显示,与对照组相比,CXCL2组和u HSC-CM组中p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平明显升高;然而与CXCL2组相比,SB225002组、JDF组p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平明显降低。与u HSC-CM组相比,a HSC-CM组中p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平明显升高。与a HSC-CM组相比,SB225002组和JDF组中p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平明显降低。结论金猫解毒方能够抑制小鼠肝原位移植瘤模型中CD11b+GR1+MDSCs的数量,体外抑制a HSC诱导的MDSCs募集及分化,其作用可能与阻断CXCL2-CXCR2-ERK和CXCL2-CXCR2-AKT通路有关。