秀珍菇漆酶特性及其应用研究

作     者：赖春芬 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙淑静

授予年度：2018年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：漆酶 转录组分析 分离纯化 秀珍菇 蔗渣 乙醇 

摘      要：漆酶(laccase,EC 1.***.3.2)属于多铜氧化酶家族,具有较强的木质素降解能力。由于漆酶有广泛的底物作用能力,能够催化氧化各类酚,因此在食品、造纸、生物能源等行业都有广泛的应用前景。漆酶在自然界中广泛存在,主要的生产者为真菌,而真菌发酵生产漆酶存在成本高的问题。本文以秀珍菇漆酶为研究对象,探究了不同营养条件下漆酶基因的转录表达水平,同时对秀珍菇菌糠中的漆酶进行分离纯化,探究了它的酶学特性及其在蔗渣生产乙醇上的应用,获得的主要研究结果如下:1.不同营养条件下秀珍菇漆酶基因转录表达分析不同营养条件下培养的秀珍菇转录组测序获得长度分布在200～2000bp的单基因簇(unigene)54828条,成功注释到基因序列45134条,获得11条漆酶基因序列,标记为lac1～lac11,qRT-PCR验证7个漆酶基因表达水平与转录组测序分析结果趋势一致。其中铜离子对漆酶基因表达的具有明显的促进作用,碳氮胁迫会提高lac1、lac6、lac7、lac8、lac11这5个漆酶基因的表达,添加外源木素会抑制除lac7外所有漆酶基因的表达。2.秀珍菇菌糠漆酶分离纯化及其酶学性质研究在最佳条件(料水比1:10、温度25℃、时间30 min、摇床转速160 r/min)下提取秀珍菇菌糠的漆酶粗酶液,利用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Cellulose亲和层析技术过柱纯化,纯化倍数达43.27,回收率为45%,比酶活为15.72 U/mg。SDS-PAGE电泳为单一条带,经质谱分析其分子量大小为29.19 kDa,空间二级结构以β-折叠为主。该酶的最适反应条件为40℃、pH4.5,在20～25℃和pH7.5～8.5稳定性良好。金属离子及抑制剂对漆酶活力影响很大,Mn2+、NH4+、Tris、尿素等对该酶有激活作用,Ba2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、K+、SDS、EDTA、吐温80等对漆酶有较大抑制作用,其中Fe2+、β-巯基乙醇会导致漆酶完全失活,该酶的Km值为1.513 mM。3.漆酶在蔗渣发酵生产乙醇中的应用将漆酶粗提液利用喷雾干燥技术在最优条件(进风温度95℃、进料速度20mL/min、热风流量3.5m3/min)下制备漆酶酶制剂,利用该酶(酶活0.5 U/mL)处理蔗渣发酵生产酒精,酒精产量有了明显的提升,水解液、蔗渣、混合发酵分别提高11%,15.8%,6.6%,说明漆酶对提高蔗渣的降解效果明显,可提高酒精产量。