Foxg1通过促进成年神经发生改善阿尔茨海默病的机制研究

作     者：翟鸿儒 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王佳

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 Foxg1 成年神经发生 细胞周期 

摘      要：阿尔茨海默病（Alzheimer s disease,AD）是一种与年龄相关的,以记忆衰退和认知障碍为主要症状的神经退行性疾病。神经元丢失是其主要的病理学特征之一,针对于此,除改善神经元凋亡及其功能丧失以外,促进成年新生神经元的产生是当下研究的新方向。在成年哺乳动物海马中,神经干细胞与神经祖细胞持续分裂并产生新的神经元,这一过程被称为成年神经发生。成年神经发生是一个多步骤的生理过程,包括了成体神经干细胞增殖、分化、迁移并整合进入成体神经网络的整个过程,其结果是产生终末分化成熟神经元。成年哺乳动物神经发生功能损伤与神经退行性疾病,如阿尔茨海默病密切相关。促进海马齿状回（dentate gyrus,DG）中神经前体细胞有效分化为成熟神经元有助于神经退行性疾病的预防与修复。Foxg1是连接人类认知功能和大脑疾病的关键转录因子,其对于胚胎发育及幼年期的神经发生至关重要,其缺失将导致整个大脑半球发育不良。然而,Foxg1不仅仅局限于胚胎发育期的大脑,其在出生后仍可持续表达于成年神经干细胞聚集区。Foxg1在成年海马神经发生中的作用,及其能否通过促进成年神经发生改善阿尔茨海默病,截至目前,国内外鲜有报道。研究目的（1）检测Foxg1与成年神经干细胞的增殖、活化的相关性;（2）探究Foxg1能否通过调控细胞周期影响成年神经干细胞的增殖与分化;（3）探究Foxg1能否促进成年神经前体细胞谱系进展;（4）探究Foxg1能否通过调控成年神经发生改善AD。研究方法（1）检测Foxg1与成年神经干细胞的增殖、活化的相关性（1）体内模型:通过脑区定点微注射技术及Cre-AAV介导的基因重组技术诱导FOXG1在Foxg1小鼠（4月龄）海马DG颗粒下区（subgranular zone,SGZ）过表达。通过HE染色判断注射位点的准确性;利用免疫荧光技术通过EGFP标签抗体检测FOXG1过表达情况。利用免疫荧光技术、免疫组化技术和Western Blot检测FOXG1过表达对a NSCs增殖的影响;利用免疫荧光双重标记法进一步确认FOXG1过表达对a NSCs的影响并检测其对a NSCs活化的影响。（2）体外模型:提取Foxg1与Foxg1-Cre AAV小鼠海马原代神经细胞并进行体外培养,通过无血清培养基培养法抑制成熟神经细胞生长并去除维生素A以抑制离体神经干细胞分化以获得原代NSCs,在悬浮培养状态下使用光学显微镜对其进行观察以评估FOXG1过表达对体外神经球成球速率的影响。（2）探究FOXG1能否通过调控细胞周期影响成年神经干细胞的增殖与分化体外模型:以NA细胞系作为研究对象,通过脂质体转染法,使用pECMV/Foxg1质粒转染细胞。通过Western Blot技术对质粒转染诱导的FOXG1过表达进行验证;通过流式细胞术检测FOXG1过表达对P21表达的影响;再将流式细胞PI染色与P21免疫染色相结合,探究FOXG1能否通过抑制P21影响细胞周期;使用Hoechst33342与Pyronin Y对NA细胞DNA与RNA进行染色,通过流式细胞术检测FOXG1过表达对细胞DNA与RNA含量的影响以评估FOXG1过表达能否促进细胞周期退出。以HEK293-T细胞作为研究对象,引入荧光泛素化细胞周期指示剂FUCCI,使用AAV载体包装的FUCCI病毒感染细胞,使用嘌呤霉素（puromycin）对感染后的细胞进行筛选。通过脂质体转染法,使用pECMV/Foxg1质粒转染FUCCI细胞。通过Western Blot技术对质粒转染诱导的FOXG1过表达进行验证;通过荧光显微镜观察检测FUCCI系统追踪的FOXG1过表达诱导的细胞周期变化。（3）探究FOXG1能否促进成年神经前体细胞谱系进展（1）体内模型:在验证FOXG1过表达模型构建成功的基础上,通过免疫荧光技术、免疫组化技术、Western Blot检测FOXG1过表达对神经元谱系标志物表达的影响,从而评估FOXG1过表达能否促进成年a NSCs谱系进展。（2）体外模型:以NA细胞系作为研究对象,使用转染pECMV/Foxg1质粒后的细胞,使用荧光标记鬼笔环肽对成年小鼠海马DG区丝状肌动蛋白细胞骨架进行染色标记,荧光显微镜检测其突触生长情况以评估FOXG1过表达能否增强有丝分裂后神经元突触可塑性。（4）探究FOXG1能否通过调控成年神经发生改善AD体内模型:引入九月龄APP/PS1小鼠作为AD体内模型,通过脑区定点微注射技术将Foxg1-AAV及其空载病毒注射到AD小鼠病变脑区,从而诱导FOXG1在AD小鼠的海马DG区中过表达,HE染色后观察针孔位置,若针孔最深处位于小鼠海马DG区,则证明注射位点正确;利用免疫荧光技术通过GFP标签抗体检测FOXG1过表达情况。通过免疫荧光技术检测FOXG1过表达对a NSCs增