利用孕妇外周血cfDNA甲基化差异片段预测胎盘疾病的初步研究

作     者：徐秀廷 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余波澜

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：液体活检 DNA甲基化 胎盘植入 子痫前期 疾病预测模型 

摘      要：背景妊娠相关疾病的发病机制和胎盘的病理生理状态密切相关,诸多妊娠相关疾病如子痫前期和胎盘植入等,均起源于胎盘的发育障碍和功能损伤,并严重威胁孕妇和胎儿的生命安全。建立简单有效的胎盘疾病预测方法从而预防严重不良妊娠结局至关重要。DNA甲基化是表观遗传学修饰的一种重要形式,胎盘DNA甲基化的变异可能诱发胎盘疾病的发生。孕妇外周血中来源于胎盘的细胞游离DNA片段(cell-free DNA,cfDNA),可作为无创产前诊断的分子标记物,在全孕期动态监控胎盘的发育和功能。目前利用孕妇外周血cfDNA甲基化预测子痫前期和胎盘植入等胎盘疾病的研究未见报道。目的本研究首先对正常对照(normal,NOR)、子痫前期(preeclampsia,PE)和胎盘植入(placenta accreta spectrum,PAS)三类孕产妇进行胎盘DNA甲基化测序,利用差异甲基化基因片段筛选出潜在的胎盘疾病分子标记物。随后,设计外周血cfDNA扩增引物并建立外周血cfDNA甲基化检测技术。最后,通过检测孕妇外周血cfDNA的胎盘差异甲基化基因片段,结合孕妇临床信息建立预测子痫前期和胎盘植入的模型,并在孕早期临床样本中进行验证。方法(1)本研究收集并提取44份胎盘DNA用于RRBS测序(NOR组14名,PE组14名,PAS组16名)(2)通过分析PE和PAS的胎盘DMR,聚焦位于CGI和启动子区域,筛选与胎盘发育和血管生成相关的基因,利用这些基因设计引物,构建双标曲定量甲基化特异PCR(Quantitive Methylation-Specific PCR)q MSP技术和cfDNA甲基化的技术平台。我们设计8个位点作为一个panel,以LINE1作为内参,检测样本8个位点的cfDNA甲基化情况。(3)为了建立和验证外周血cfDNA预测模型,采用病例对照研究和前瞻性队列研究,其中病例对照研究产生的数据用于构建疾病预测模型,队列研究用于验证疾病预测模型。病例对照样本纳入98名孕妇(NOR组29名、PE组33名和PAS组36名),检测外周血cfDNA甲基化情况。我们利用logistics回归,联合外周血cfDNA标志物和孕妇临床指标构建疾病预测模型。在队列研究中,我们共收集从孕早期到孕晚期7次队列研究的候选者的外周血样本(标记为T1-T7),队列研究总共纳入41名孕妇共263例血浆样本,对照组15人次共96份血浆样本、PE组19名共121份血浆样本和PAS组7名共46份血浆样本。结果(1)对胎盘RRBS的DMR进行GO富集分析,结果显示,GO term angiogenesis出现在三个比较组中前25个被富集的生物学过程,而GO term vasculogenesis是NOR vs PE组前20个最显著被富集的GO term之一,血管生成相关的基因在PE和PAS疾病的胎盘中存在显著的DNA甲基化变化。(2)病例对照研究结果显示,PE组比NOR组中BMPR2(p0.05)、EPN2(p0.01)、STOX2(p0.01)甲基化程度升高,ITGAV(p0.001)、KLF5(p0.01)基化程度降低;PAS组比NOR组中EPN2(p0.1)、ITGAV(p0.001)、KLF5(p0.1)、ADGRB3(p0.001)甲基化程度升高,BMPR2(p0.01)甲基化程度降低;PE组较PAS组的BMPR2(p0.001)、STOX2(p0.05)甲基化程度升高,BMP4(p0.05)、ITGAV(p0.001)、KLF5(p0.001)、ADGRB3(p0.001)甲基化程度降低。(3)队列研究结果显示,PAS与NOR组相比,EPN2等多个基因的平均甲基化率较低,有统计学差异的时期如下:EPN2在T4(p0.05)和T6(p0.01),ITGAV在T1(p0.05)、T2(p0.05)、T4(p0.01)、T5(p0.01)和T6(p0.01),KLF5在T2(p0.05)和T3(p0.05),ADGRB3在T4(p0.05)和T5(p0.05)。队列样本中PE与NOR组相比,各个时间点的ITGAV和KLF5的平均甲基化率都较低,具有统计学差异的时间点如下:ITGAV在T6(p0.1),KLF5在T5(p0.05);队列样本中PE与NOR组相比EPN2在T4之前高于对照,T4时期之后低于对照(T6 p0.05);ADGRB3则未观察到显著差异。(4)使用病例对照研究的数据利用logistics回归构建疾病预测模型和ROC曲线构建,PE预测模型Model A纳入四个甲基化位点,Model B纳入四个甲基化位点以及孕妇年龄和孕早期身体质量指数(Body Mass Index,BMI)。结果表明,病例对照研究Mo