细胞外囊泡新功能及其与子痫前期的相关性的研究
作者单位：广州医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：杨红玲
授予年度：2023年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学]
摘 要：目的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle,EV)是近年来备受关注的研究对象之一,然而在其功能方面的研究仍存在着许多未知。它们存在于生物体液中,参与多种生理和病理过程。子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种妊娠特异性综合征,其发病机制尚不完全清楚,滋养细胞侵袭不良是PE的主要病理生理改变。因此,我们对细胞外囊泡的新功能进行深入探索,并研究细胞外囊泡对PE滋养细胞侵袭不良的作用。方法一、无细胞状态下细胞外囊泡培养条件筛选1.培养条件的选择(1)培养基与血浆比例的选择:使用同一培养基与血浆以不同比例混合后,培养72小时后分离和裂解细胞外囊泡,提取和检测囊泡蛋白含量,以囊泡蛋白量最高的结果所用比例为最佳。(2)培养基的选择:分别用三种培养基(全血细胞培养基、1640培养基、羊水细胞培养基)对血浆外囊泡进行培养。培养基和血浆按上述最佳比例(2:1)混匀,培养72小时后分离和裂解细胞外囊泡,提取和检测囊泡RNA和DNA含量,以RNA和DNA含量最高的结果所用培养基为最佳。(3)培养时间的选择:使用上述筛选到的最佳培养基,按培养基:血浆=2:1的比例混匀血浆,在培养0h,12h,24h,48h,72h时收获培养悬液,分离收集得到细胞外囊泡,以纳米粒子追踪分析技术(Nanoparticle tracking analysis,NTA)检测囊泡浓度,以囊泡增长效率最高的培养时间点为最佳。2.细胞外囊泡及其核酸和蛋白的分离检测(1)细胞外囊泡的分离:根据尺寸排阻色谱法(SEC)原理使用Exosupur试剂盒(Echo Biotech,中国北京)从血浆中提取细胞外囊泡,最后用10 kDa的Amicon?超滤管(默克,德国)将馏分悬液浓缩。(2)细胞外囊泡蛋白的提取及检测:将提取得到的细胞外囊泡悬液裂解得到囊泡总蛋白,使用PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific,USA)通过BSA标准蛋白质溶液曲线计算样品的蛋白质含量。(3)细胞外囊泡核酸的提取及检测:分别使用DNA分离试剂盒(Rengen Biosciences Co.),Trizol 试剂(Invitrogen)提取囊泡总 DNA 和总 RNA。使用仪器NanoDrop ND-1000测量样品的核酸质量和OD260/280值,并通过标准变性凝胶电泳评估核酸完整性。(4)细胞外囊泡浓度NTA检测:采用激光光源照射纳米颗粒悬浮液,检测纳米颗粒的散射光,通过统计散射颗粒的数量来计算纳米颗粒浓度。以30帧/秒的帧速率,拍摄持续时间为60秒的视频,并使用NTA软件(ZetaView 8.02.28)分析粒子运动。二、细胞外囊泡新功能探索1.细胞外囊泡增殖研究(1)利用新鲜血浆以0.2μm滤膜过滤除菌处理,采用上述培养条件加入2倍体积的培养基,分别于0h和72h收集培养悬液。分离提纯培养悬液细胞外囊泡,NTA检测粒子浓度。细胞外囊泡增生能力以颗粒数量、大小和运动来诠释。(2)采用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)及WB实验检测囊泡的形态及标志性蛋白来鉴定细胞外囊。2.细胞外囊泡功能研究(1)囊泡迁移及侵袭功能研究:采用xCELLigence RTCA(ACEA Biosciences)仪器检测细胞外囊泡的迁移及侵袭功能。将囊泡悬液加入RTCA微孔板(CIM-Plate 16,ACEA Biosciences),置于仪器中孵育24h,期间每15分钟自动监测10秒,数据以细胞指数(cell index,CI)表示,用以计算细胞外囊泡的迁移及侵袭能力。(2)细胞外囊泡半衰期推定:使用正常人群血浆以0.2μm滤膜过滤除菌处理,于37℃培养箱中孵育30天,每天收集一份培养物,分离提纯细胞外囊泡并检测囊泡RNA及蛋白量。以囊泡RNA和蛋白量减少至50%的时间推定为囊泡半衰期。3.细胞外囊泡与PE滋养细胞侵袭不良的相关性研究(1)收集6例健康孕妇和6例PE孕妇,二组孕妇进行年龄、孕周匹配;采集孕妇全血4ml,分离血浆用0.2μm滤膜作除菌处理,按1:2加入培养基中培养Oh和72h后收集,分离提纯得到细胞外囊泡共4组,采用NTA技术分析研究外囊泡与PE的相关性。(2)将滋养细胞分别与4组囊泡混合培养12小时,采用xCELLigence RTCA(ACEA Biosciences)仪器检测滋养细胞的迁移及侵袭功能,探索PE孕妇血浆囊泡对PE滋养细胞侵袭不良的作用。结果1.血浆细胞外囊泡培养条件(1)囊泡蛋白检测结果显示,培养基与血浆按不同比例培养后提取的囊泡的蛋白浓度与培养前相比均明显增多(P0.05);与PE母本囊泡相比,PE新生囊泡(PE-72h组)对滋养细胞侵袭功能的抑制作用更强(0.70±0.15 vs.0.23±0.05,P=0.0017)。结论1.经体外适宜条件培养后,离开母体细胞的细胞外囊泡会产生新的子代细胞外囊泡,具有自我增殖能力;除增生能力外,无论是母本还是子代细胞外囊泡均具有独立的迁移和侵袭功能。2.健康组与子痫前期患者的血浆细胞外囊泡存在着数量和功能的差异。PE患者的血浆囊泡可抑制滋养细胞迁移和侵袭功能。我们的研究表明,细胞外囊泡具有一种以前未被认识到的产生功能性后代的能力,且其对滋养细胞的影响可能与PE病程发生发展相关。
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