抗新型冠状病毒中和抗体组合的筛选

作     者：张绪磊 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：庾蕾

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：SARS-CoV-2 Omicron变异株 中和抗体 假病毒 中和活性 免疫逃逸 抗体组合 

摘      要：研究背景由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronaviru s 2,SARS-CoV-2)感染引起的全球新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease,COVID-19)的大流行,导致了严重的公共卫生负担和社会经济危机。中和抗体已被证明对治疗轻度和中度COVID-19患者非常有效。然而,由病毒快速突变产生的一系列O micron亚型株逃逸了大多数商业化的治疗性抗体。面对不断变异的新冠病毒以及单一抗新冠病毒中和抗体面临的耐药威胁,筛选或设计靶向SARS-CoV-2高保守位点的广谱中和抗体以及抗体的组合可能是解决病毒变异株免疫逃逸的有效措施。迄今为止,还没有一种鸡尾酒抗体或广谱抗体被证明对突变介导的抗体逃逸完全免疫。综合考虑,开发靶向不同表位的抗体组合可以为COVID-19提供额外的治疗选择。前期实验研究中我们利用B细胞培养结合抗体克隆技术,从SARS-CoV-2感染康复患者外周血中筛选出一系列靶向新冠病毒不同表位的特异性抗体。抗体依据与病毒S糖蛋白结合分为NTD、RBD和S2特异性抗体。本研究拟探讨特异性抗体对Omicron的中和活性以及对其关键突变位点的结合能力,以筛选出有效中和不同变异株的抗体组合。第一部分Omicron变异株关键突变位点对人源中和抗体识别的影响研究内容及目的:采用定点突变的方法构建了含有Omicron关键突变位点的S1质粒,利用捕获ELISA法分析抗体825、843、809、826和846与突变位点S1蛋白的结合能力,明确关键突变位点对抗体识别的影响,预测对5株抗体产生逃逸的突变位点可能有哪些。研究方法:1.关键突变位点质粒的构建及表达:设计好含关键突变位点的引物,经PCR扩增含有突变位点的目的序列,转化目的序列到DH5α感受态细胞,挑克隆送测序,测序结果与模板质粒序列经SnapGene 比较,如为目的突变位点序列,扩大生产质粒,经转染到HEK293T细胞中进行突变位点蛋白的表达。2.捕获ELISA方法:用鼠抗包被ELISA板,可捕获表达成功的突变位点S1蛋白抗原,加入筛选出来的中和抗体,再加入带有HRP标记的羊抗人IgG(H+L),在底物TMB催化下显色。分析抗体与含Omicron关键突变位点S1蛋白抗原的结合情况。研究结果:1.一系列关键突变位点的选择依据大量文献报道,本实验总结了一些造成已获批准的COVID-19治疗性抗体逃逸的关键突变位点 T19I,del 24-26,A27S,G142D,del 143-145,S371L,S371F,S373P,S375F,D405N,K417N,N440K,G446S,E484A,Q493R,G496S,Q498R,N501Y,Q493R+G496S,Q493R+Q498R。2.关键突变位点质粒的构建与表达应用SnapGene软件将生工生物公司反馈的测序结果与模板序列进行比对分析,结果表明,利用点突变方法成功构建了含20处关键突变位点的质粒。将上述构建的部分关键突变位点质粒转染HEK293T细胞进行表达,经Western Blot分析表达鉴定,所有关键突变位点蛋白成功表达,条带大小正确。3.关键突变位点抗原稀释度的选择为接下来的ELISA实验做准备,避免所用抗原过度饱和,提高实验的灵敏性,本研究对表达的关键突变位点抗原进行梯度稀释,用特异性抗体对抗原进行了定量,选择相应的抗原稀释度。4.含Omicron关键突变位点的S1蛋白对抗体结合能力的影响809、826和843对带有单点突变S371F、S375F和G446S的S1蛋白的结合能力降低,S371F和S375F降低了 809、826、825和843对S1蛋白的结合能力。T19I、S371F和del143-145降低了 NTD区域单抗846对S1蛋白的结合能力,RBD区域的突变位点对846抗体基本不会产生影响。综上,抗体809、826、825、843对NTD区域的关键突变位点有较好的结合能力,结合能力减弱主要集中在S371F、S375F和G446S位置;846对带有突变的T19I、del143-145和S371F蛋白结合能力降低。结论:5株抗体对大部分Omicron关键突变位点有较好的结合能力。S371F、S375F和G446S 降低了抗体 809、826、825、843 的结合能力,T19I、del143-145 和 S371F 降低了 846抗体的结合能力,预示这些位点的突变有可能使5株抗体对Omicron变异株的中和作用降低或产生逃逸。第二部分基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和实验方法的建立及人源中和抗体对Omicron变异株中和活性的评估研究内容及目的:建立SARS-CoV-2假病毒中和系统,并探讨已获得针对SAR