曲妥珠单抗诱发心肌细胞铁死亡体外机制研究

作     者：杨薇 

作者单位：哈尔滨医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨力明

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：曲妥珠单抗 铁死亡 肿瘤心脏病 线粒体功能障碍 PI3K/AKT/Nrf2 

摘      要：背景及目的:2020全球癌症统计显示乳腺癌发病率居首位。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是靶向人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的人源化抗体,其在乳腺癌的免疫疗法中发挥着重要作用,可显著提高患者的预期寿命,但容易诱发心肌毒性。铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡模式,铁离子累积和脂质过氧化是铁死亡的基本特征。铁死亡参与动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤和心力衰竭等多种心血管疾病的发生和发展。阿霉素心脏毒性与脂质过氧化物积累以及线粒体铁超载密切相关,Trastuzumab引起的心肌细胞损伤是否和铁死亡相关目前未见报道。课题组前期实验发现Trastuzumab可引起小鼠心功能降低,本研究以细胞铁死亡为切入点,深入探究Trastuzumab对小鼠心肌细胞心肌毒性的分子机制,为预防和治疗肿瘤心脏病提供新思路。方法:1.铁死亡抑制剂Fer-1或DFO干预Trastuzumab处理的HL-1心肌细胞,通过细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞存活率;利用定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR）和Western blot从转录和翻译水平检测铁死亡相关蛋白表达情况;2-7-二氯荧光素乙酯（2-7-Dichlorouorescin diacetate,DCFH-DA）染色检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）;流式细胞术检测细胞内脂质ROS水平;丙二醛（Malonaldehyde,MDA）检测试剂盒检测细胞内MDA的含量变化;还原型谷胱甘肽（L-Glutathione,GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione,GSSG）检测试剂盒检测GSH/GSSG比值;铁离子检测试剂盒测定细胞内Fe水平。2.铁死亡抑制剂、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3kinase,PI3K）激动剂和抑制剂干预Trastuzumab处理的HL-1心肌细胞,Western blot检测PI3K和蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）的磷酸化水平,以及Nrf2的蛋白表达;免疫荧光检测Nrf2核转位情况。3.铁死亡抑制剂Fer-1或DFO干预Trastuzumab处理的HL-1心肌细胞,Western blot检测检测线粒体内GPx4、4-HNE的表达;Mito Sox检测线粒体内ROS的变化;线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability Transition pore,MPTP）检测试剂盒检测线粒体膜通透性变化;线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测线粒体膜电位的变化;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;试剂盒检测NAD/NADH以及NADP/NADPH比值;免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测电压依赖阴离子通道1（Voltage-dependent anion channel 1,VDAC1）与4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）的相互作用。结果:1.Trastuzumab处理HL-1细胞,细胞存活率降低,细胞内GPx4蛋白和m RNA表达下降,Erb B2、4-HNE蛋白上升;DCFH-DA染色检测细胞ROS增加,流式细胞术检测发现细胞内脂质ROS水平升高,MDA含量增加,GSH/GSSG比值降低,细胞内Fe水平升高;铁死亡抑制剂Fer-1或DFO干预,逆转Trastuzumab对HL-1细胞的上述效应。2.Trastuzumab处理HL-1细胞,Western Blot检测显示PI3K和AKT的磷酸化水平降低,Nrf2的蛋白表达下降。PI3K激动剂干预后,PI3K和AKT的磷酸化水平和Nrf2的蛋白表达上升,并提高了Nrf2核转位;对Erb B2的表达没有影响。3.Trastuzumab处理HL-1细胞,Western Blot检测检测线粒体内GPx4表达降低,4-HNE表达增加,线粒体内ROS增加,线粒体膜通透性增加,线粒体膜电位降低,细胞内ATP水平下降,NAD/NADH和NADP/NADPH比值下降;铁死亡抑制剂Fer-1或DFO干预,逆转Trastuzumab对HL-1细胞的上述效应。Co-IP提示VDAC1与4-HNE存在相互作用。结论:1.Trastuzumab通过抑制PI3K/AKT信号通路,降低Nrf2核转位,引起脂质ROS蓄积,诱导HL-1小鼠心肌细胞发生铁死亡;2.Trastuzumab通过增加线粒体VDAC1表达,引起线粒体脂质过氧化,导致HL-1小鼠心肌细胞线粒体功能障碍。