激素敏感性脂肪酶在斑马鱼营养代谢稳态维持中的功能研究

作     者：王金港 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜震宇

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071002[理学-动物学] 

主      题：脂滴水解 激素敏感性脂肪酶 代谢稳态 糖代谢 脂代谢 蛋白代谢 脂肪酸谱 斑马鱼 

摘      要：脂质代谢在维持能量平衡中起着重要作用,其紊乱会引发一些代谢性疾病,如脂肪肝、2型糖尿病和心血管疾病等。作为脂质代谢的核心过程,脂滴水解的定义为细胞内甘油三酯(triacylglycerol,TG)在多种酶的协同作用下被分解释放游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)和甘油的生化过程。其中,激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)在该过程中主要负责TG和甘油二酯(diacylglycerol,DG)的分解。脂滴水解是调控甘油三酯动员和储存的一个关键过程。与甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和甘油一酯脂酶(monoglyceride lipase,MGL)这两种中性脂肪酶相比,HSL对于神经-体液信号响应更为敏感,在儿茶酚胺类激素调控下会被磷酸化激活,通过构象改变极显著增强脂解功能。此外,HSL展现出独特的底物广泛性,能够有效地水解TG、DG和甘油一酯(monoglyceride,MG),甚至胆固醇以及其他底物。这些特点使HSL在基础脂解和刺激条件下的脂肪分解中发挥关键作用。此外,在水产养殖中水生动物脂肪的过度沉积已成为非常严重的问题,这对养殖鱼类造成了许多不良影响,并且研究发现脂肪过度沉积的鱼类通常伴随着hsl基因的异常表达。而Hsl作为一种脂滴水解过程中非常重要的代谢酶,其在鱼类营养代谢调控中发挥的功能还尚无详细的研究。斑马鱼(Danio rerio)作为经典的动物模型,被广泛用于人类疾病研究和基础生物学问题的探讨。因此,在本研究中我们采用抑制Hsl酶活和基因敲除或两种方式来构建Hsl功能缺陷的斑马鱼模型,通过测量生长、运动能力、耗氧率、以及脂质、糖原和蛋白质代谢中关键生化指标、利用H&E和Oil Red染色切片,薄层层析、ELISA、RT-q PCR、Western blot和GCMS气相色谱法–质谱法联用等技术手段,从Hsl功能缺陷的角度去探讨Hsl在鱼类系统性营养代谢中发挥的具体功能。本论文的主要结果如下:1.抑制Hsl酶活对于斑马鱼系统性营养代谢的影响先前的研究表明,机体能量代谢始终处于一种动态平衡中,脂代谢、蛋白代谢和糖代谢三大代谢途径彼此之间会互相影响,维持机体代谢稳态。如果营养代谢稳态失衡,就会造成脂肪严重积累等代谢性疾病。在水产养殖实际生产中发现脂肪过度沉积的鱼类通常伴随着hsl基因的异常表达,但Hsl在鱼类营养代谢调控过程中到底发挥着怎样的作用目前仍鲜有报道。因此,我们对雄性斑马鱼进行随机挑选并将其分为两组(对照组和抑制剂HSL-IN-1处理组),开展为期5周的养殖实验。养殖结束后进行组织取样并保存,我们通过检测了斑马鱼的生长与运动、与脂代谢、蛋白代谢和糖代谢相关的生化指标、肝脏H&E和Oil Red染色切片,三大代谢途径相关基因和蛋白的表达水平,抗氧化酶活性和炎症凋亡相关基因表达水平等指标。结果显示,HSL-IN-1处理组斑马鱼的肥满度、全鱼总脂、血浆TG明显升高,且在鱼体解剖过程中,该组发现了明显的脂肪组织增大,而在对照组斑马鱼没有观察到类似现象;此外,HSL-IN-1处理组斑马鱼耗氧率较低,但运动能力没有受到影响;在全鱼脂质组成中发现,TG和DG含量占比显著增加,而MG和磷脂PL含量占比显著下降;在糖代谢中,HSL-IN-1处理组斑马鱼肌肉糖原含量显著下降,并且肝脏和肌肉的糖原磷酸化和糖酵解相关基因表达显著增强;在蛋白代谢中,HSL-IN-1处理组斑马鱼全鱼总蛋白含量显著降低,并且调控蛋白合成的核心蛋白m TOR蛋白表达含量显著减少,而氨基酸代谢相关基因的表达水平显著上调。以上结果说明生化抑制斑马鱼Hsl酶活性会导致斑马鱼脂分解代谢紊乱,造成脂肪过度沉积,同时引起机体组织高水平的炎症和抗氧化降低,影响机体健康。2.斑马鱼hsla-KO模型的构建小分子抑制剂的使用虽然可以有效针对于靶标蛋白发挥抑制作用,但是同时可能存在一些负面效应,比如产生活性代谢物对组织机体产生毒理效应。随着基因编辑技术的发展,CRISPR-Cas系统因高效、快捷、方便等特点逐渐被广泛应用于生命科学研究当中。多模型以及多种技术手段联合使用来探究具体的科学问题已成为当今的主流趋势。因此,我们通过CRISPR-Cas9技术构建了hsla斑马鱼模型,从结果来看:斑马鱼编码hsla基因的CDS序列中的第一个外显子出现了7bp的碱基缺失,导致移码突变,Hsl蛋白翻译过程由原本696个氨基酸提前终止为51个氨基酸,并且仅保留了43个氨基酸,因此可确定该突变为有效突变;从hsla基因表达的情况来看,hsla在斑马鱼核心代谢组织肝脏、肌肉和内脏团具有较高的表达;油红染色实验结果表明,与十五天龄的WT斑马鱼相比,hsla斑马鱼腹部具有更为明