羊源多杀性巴氏杆菌感染影响小鼠肺脏转录组的研究

作     者：程逸文 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡日查;王凤阳

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：多杀性巴氏杆菌 转录组测序 ExbD基因 原核表达 

摘      要：多杀性巴氏杆菌病是养殖业中经常出现的一种细菌性疾病,该菌通常情况下广泛存在于动物体内而不致病,当机体免疫力降低或饲养环境恶化等情况出现时,便可大量繁殖损伤动物健康,给畜牧养殖带来较大的经济损失。本实验选择实验室自行分离鉴定的羊源HN01株多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）作为研究对象,对其相关特性和发病机理进行初步探究并获得如下实验结果:实验一,对Pm HN01株进行革兰氏染色,绘制HN01株Pm 30 h内的生长曲线,并制作得到其线性回归方程。用该菌对SPF昆明小鼠进行攻毒测定半数致死量LD,最终测得LD为3.16×10～4CFU。用感染小鼠的病变组织制备病理组织切片,观察到肺脏和脾脏组织间均出现大量炎性细胞,并伴有红细胞淤积,肺泡上皮细胞有脱落。实验二,对SPF级昆明小鼠腹腔注射50倍LD的Pm HN01株菌液,采集新鲜死亡的小鼠肺脏组织送至公司提取RNA进行有参转录组测序。分析测序结果可得:（1）各组样品质量均合格,碱基质量值≥Q30的Reads比例高于94%,与参考基因组匹配率在95%左右;（2）各样本间的基因表达水平大致相同,与对照组相比,显著值P0.05且|log2（fold change）|≥1的差异表达基因共2976个,其中表达量上升和下降的基因数分别为1605和1371个;（3）在进行GO注释富集分析后发现,差异表达基因在3种GO分类中富集的GO term数量接近,其中病毒组装（GO:0019068）、免疫反应（GO:0006955）、细胞质（GO:0005829）等GO terms存在差异表达基因显著大量富集;（4）经KEGG注释富集分析后发现,差异表达基因被显著富集在病毒蛋白与细胞因子及受体相互作用（ko04061）、细胞增殖和凋亡相关的MAPK（ko04010）、细胞因子受体（ko04060）等KEGG通路;（5）铁死亡通路（ko04216）的富集因子达1.4,通路中显著差异表达基因基本呈上调趋势。（6）经q RT-PCR验证,Il1r2、Cd14、Cd33、Mt1、Nfkbia、Saa3、S100a9、Ccl9、STAT3表达量均显著上调,Il4ra表达量显著下调。实验三,以Pm HN01株基因组为模板,扩增铁调节相关基因Exb D,诱导表达目的蛋白,并进行相应的生物信息学分析。结果表明:扩增基因条带在390 bp处,SDS-PAGE和Western blot显示蛋白条带在19 k D处,均符合预期;HN01株中的该基因与HN02株Pm的亲缘性最近,而Exb D蛋白预测是以α-螺旋和无规则卷曲为主要二级结构的酸性稳定蛋白。综上所述,Pm HN01株的LD为3.16×10～4CFU,对小鼠主要造成肺脏和脾脏的损伤;Pm感染小鼠后,引起小鼠免疫、转导等通路或相关基因的显著差异变化。