基于miRNA组学探讨补肾调冲汤干预BMSCs外泌体对薄型子宫内膜的机制研究

作     者：汤舒荻 

作者单位：广西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：伍娟娟

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：补肾调冲汤 BMSCs 外泌体 薄型子宫内膜 高通量测序 

摘      要：目的:本研究通过建立薄型子宫内膜大鼠模型,探讨补肾调冲汤对BMSCs外泌体mi RNA表达的影响,预测其潜在靶基因及参与的生物学过程,进而探讨补肾调冲汤干预BSMCs外泌体治疗薄型子宫内膜的可能作用机制。方法:(1)采用数字随机法,将42只7-8周龄的SPF级SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和低、中、高剂量中药组。除正常组外,将其余5组大鼠在动情期时建立薄型子宫内膜大鼠模型,并用HE染色法来鉴定。低、中、高剂量中药组各予含生药量0.8525g/ml、1.705g/ml、3.4 1 0 g/m l的补肾调冲汤灌胃;西药组予浓度为0.0 1 m g/1 0 0 g的戊酸雌二醇片灌胃;正常组和模型组予生理盐水灌胃,剂量为1ml/100g,每天1次,连续7天。腹主动脉采血,制备含药血清。(2)全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs,传代至P3代。取生长状态良好的P3代BMSCs,通过倒置显微镜观察细胞形态和流式细胞术检测细胞表面标记物CD34、CD44和C D 9 0来鉴定。(3)将P 3代B M S C s随机分为对照组、正常组、模型组、西药组和低、中、高剂量中药组,以对应含药血清分别培养24h、48h、72h。运用CCK-8法检测BSMCs的增殖情况,后筛选出补肾调冲汤的最佳剂量作为后续实验中药血清组的补肾调冲汤剂量。(4)利用超高速离心法提取BMSCs外泌体,通过电镜、NTA和Western Blot分别检测外泌体的形态、粒径和表面标记物TSG101、Calnexin来鉴定。(5)运用高通量测序技术,筛选出正常血清组、模型血清组、中药血清组和西药血清组,两两组间BMSCs外泌体的差异表达m i R N A,并预测靶基因,通过G O功能和K E G G通路富集分析,探讨其参与的生物学过程。结果:(1)与正常组相比,模型组大鼠的子宫内膜厚度明显变薄,间质较疏松,血管和腺体的数量减少。(2)镜下可见P3代BSMCs为贴壁生长,形态一致,呈长梭形;排列整齐,分布有序,走向为旋涡状或放射状;细胞间连接非常紧密。流式细胞仪检测BSMCs高度表达CD44和CD90,而几乎不表达CD34。(3)CCK-8法检测各组BSMCs增殖结果:(1)与同时间段对照组比较,低、中、高剂量中药组和西药组在24h、48h和72h中的OD值均有所上升(P0.05);(2)与同时间段西药组和低剂量中药组对比,高剂量中药组在24h、48h、72h中的OD值均有所升高(P0.05);(3)与同时间段的中剂量中药组对比,高剂量中药组在48h、72h中的OD值均有所升高(P0.05);(4)低、中、高剂量中药组的OD值随时间的增长而上升,24h48h72h(P0.05)。(4)电镜下观察外泌体呈椭圆形或圆形的囊泡状结构,具有完整的双层膜结构,形似“茶托。NTA检测外泌体平均粒径为73,09nm,大小分布均匀。Western Blot检测TSG101呈阳性表达,C a l n e x i n呈阴性表达。(5)通过高通量测序技术筛选出各组间的差异表达mi RNA:(1)正常血清组和模型血清组间:mi R-141-3p为上调基因,mi R-351-5p、mi RNA-451-5p为下调基因;(2)模型血清组和中药血清组间:mi R-21-5p、mi R-31a-5p、mi R-181a-5p、mi R-195-5p、mi R-503-5p、mi R-132-3p为上调基因,let-7bc-5p、let-7b-5p、mi R-223-3p、mi R-122-5p为下调基因;(3)模型血清组和西药血清组间:mi R-103-3p、mi R-31a-5p、mi R-351-5p为上调基因,mi R-223-3p、mi R-126a-3p、mi R-122-5p、mi R-141-3p为下调基因;(4)中药血清组和西药血清组间:mi R-103-3p为上调基因,mi R-150-5、mi R-503-5p为下调基因。(6)通过GO功能和KEGG通路富集分析发现:(1)正常血清组和模型血清组间mi RNA靶基因主要涉及的细胞学组分共有110个,包括:突触、突触小泡等;生物学过程共有609个,包括:钾离子跨膜转运、细胞钾离子转运等;分子生物学功能共有80个,包括:钾通道活性、电压门控钾通道活性等;主要参与的信号通路共有39条,包括:河马信号通路、胞吞作用等。(2)模型血清组和中药血清组间mi RNA靶基因主要涉及的细胞学组分共有130个,包括:神经元投射、突触等;生物学过程共有488个,包括:神经元投射延伸、本地化规定等;分子生物学功能共有103个,包括:转移酶活性,蛋白激酶活性等;主要参与的KEGG通路有50条,包括:Wnt信号通路、HIF-1信号通路等。(3)模型血清组