三氧化二砷对小鼠黑色素瘤B16细胞抑制增殖的机制研究

作     者：郭凯凯 

作者单位：海南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：高畅

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：三氧化二砷 黑色素瘤B16细胞 细胞凋亡 细胞自噬 细胞周期 

摘      要：目的:三氧化二砷（Arsenic trioxide,AsO）抑制黑色素瘤细胞增殖的作用机制尚不明确。本研究旨在通过有参转录组和代谢组学筛选相关通路,探究三氧化二砷对黑色素瘤B16细胞凋亡、自噬、周期的影响及可能分子机制。方法:（1）MTT法检测细胞增殖:选择指数增长期的小鼠黑色素瘤B16细胞接种于96孔板并与AsO共培养48 h后,采用MTT法检测不同浓度的AsO（0μM、0.02μM、0.039μM、0.078μM、0.156μM、0.312μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM）对小鼠B16细胞的生长活性抑制情况;（2）流式细胞术实验:在明确三氧化二砷抑制B16细胞增殖有效浓度的基础上,运用流式细胞术检测特定浓度范围的AsO诱导B16细胞发生凋亡以及细胞周期改变的情况;（3）透射电镜实验:运用透射电镜观察AsO诱导B16细胞凋亡和自噬的情况。（4）有参转录组测序和代谢组学分析:将AsO（10μM）与B16细胞共培养48 h后,分别收集细胞团块与细胞上清液,进行有参转录组测序和代谢组学分析。（5）蛋白免疫印迹实验:检测AsO对Cleaved Caspase-9、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、CDK1等凋亡、自噬、周期相关信号通路蛋白的表达水平影响。结果:（1）小鼠黑色素瘤B16细胞与AsO共培养48 h,我们发现1.25μM的三氧化二砷能够显著抑制B16细胞增殖（P0.05）,且抑制作用呈现明显的剂量依赖性,IC50为5.68μM。（2）通过流式细胞术,我们观察到三氧化二砷能够显著诱导细胞凋亡（P0.05）,细胞凋亡比率与药物浓度呈正相关;透射电镜下也观察到三氧化二砷诱导B16细胞中凋亡小体的形成。（3）透射电镜下观察到三氧化二砷诱导B16细胞中自噬溶酶体的形成。（4）通过流式细胞术,我们观察到三氧化二砷可使B16细胞的细胞周期停滞在G1期（P0.001）,S期细胞比例明显降低（P0.01）。（5）通过有参转录组测序分析,我们可以发现不同组的差异表达基因显著上调的有1933个,显著下调的有1181个。其中,三氧化二砷处理组的PINK1和Parkin基因都显著上调（P0.05）;处理组的CDK1基因显著下调（P0.05）,并且发现DNA复制、细胞周期和溶酶体通路等都和B16细胞的生长抑制密切相关。KEGG富集通路主要有细胞周期、自噬、DNA复制、代谢、衰老以及氧化磷酸化等。（6）通过对涉及凋亡、自噬、周期进行的相关机制进行聚类分析,我们发现相关关键基因变化为:Casp9、PINK1、Prkn、Becn1、LC3不同程度升高,CDK1降低。（7）通过代谢组学聚类分析,我们发现与B16细胞增殖密切相关的代谢物变化为:谷氨酸、二氯苯甲酸、哌啶酸、赖氨酸等代谢物显著增高（P0.05）,硫胺素显著降低（P0.05）。（8）根据转录组结果,我们通过免疫蛋白印迹法对相关蛋白进行了后续验证,发现三氧化二砷显著增加了B16细胞中Cleaved Caspase-9、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1等蛋白的表达水平（P0.05）,而显著降低CDK1的表达水平（P0.05）。结论:我们的研究结果表明,AsO对B16细胞的增殖抑制存在剂量依赖性。我们证实,三氧化二砷可能通过PINK1/Parkin途径诱导B16细胞自噬。我们推测,AsO对B16细胞的抑制作用可能与细胞凋亡、自噬的诱导、细胞周期阻滞以及由此引起的代谢改变有关。AsO对B16细胞的增殖抑制可能是这些机制共同作用的结果。