TRIM28调控永生化骨髓间充质干细胞逆转小鼠肝纤维化

作     者：冯薛佳 

作者单位：西藏农牧学院 

学位级别：硕士

导师姓名：吴庆侠;陈亮

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 CRISPR Csas9基因编辑技术 永生化 TRIM28 肝纤维化 

摘      要：肝纤维化存在于绝大多数慢性肝病过程中,长期持续肝纤维化就会发生肝硬化,甚至发展成肝癌。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,可发挥免疫调节、分泌营养因子等功能,可用于逆转肝纤维化以及促进受损组织的修复和再生。BMSC分离培养成本高,传代次数有限,且随着传代次数增加,细胞逐渐衰老,细胞活力和分化能力明显下降,以及不易进行遗传修饰,这些特性限制了基于BMSC进行的基础研究和临床应用,因此构建出永生化小鼠骨髓间充质干细胞系具有重要意义。SV40大T抗原(SV40LT)是一种由SV40(simian virus 40)病毒基因组编码的蛋白,且持续表达SV40LT会导致细胞进入永生化的增殖状态。短发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA)可以生成相应的小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA),通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默目的基因的表达。本试验利用CRISPR Cas9基因编辑技术,在小鼠BMSC的Rosa26位点敲入SV40LT基因,构建永生化的小鼠骨髓间充质细胞系(immortalized mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem cell line,im BMSC);利用慢病毒系统,构建敲低TRIM28的im BMSC(im BMSC-sh TRIM28);利用四氯化碳诱导肝纤维化模型,研究TRIM28对im BMSC逆转肝纤维化的影响。主要研究结果如下:(1)采用骨片法分离原代小鼠骨髓间充质干细胞采用骨片法分离的细胞单层贴壁生长,P0～P5代呈长梭形,边界清晰,随着代数增加,逐渐变成多边形,边界逐渐模糊;流式细胞术检测BMSC干细胞阳性细胞表面标志物和阴性表面标志物均占细胞总量的99%以上。(2)构建永生化小鼠骨髓间充质干细胞系共转染打靶质粒lenti CRISPR v2-Rosa26和供体质粒p UC19-Donor至第一代小鼠BMSCs,使用150μg/m L的G418持续筛选7 d,得到抗G418的耐药细胞,经免疫磁珠富集im BMSCs,采用有限稀释法挑选单克隆细胞。结果表明:PCR检测SV40LT定点插入至Rosa26位点;流式细胞术检测im BMSC干细胞阳性细胞表面标志物和阴性表面标志物均占细胞总量的99%以上;im BMSC细胞系呈单层贴壁生长、长梭形,与野生型BMSC相比,增殖速度快;小鼠皮下荷瘤检测im BMSC无成瘤性;im BMSC可传代超过40代,并保持原有的细胞形态和干细胞功能,可用于细胞治疗。(3)敲低TRIM28抑制im BMSC凋亡利用慢病毒系统敲低im BMSC的TRIM28,使用1μg/m L的嘌呤霉素持续筛选3 d,得到抗嘌呤霉素的细胞im BMSC-sh TRIM28。用细胞增殖和细胞凋亡实验检测TRIM28对im BMSC表型的影响。结果表明:与im BMSC-sh NC相比,im BMSC-sh TRIM28的TRIM28表达下调;CCK-8检测显示敲低TRIM28对im BMSC增殖的影响无显著性差异;Annexin V-FITC/PI染色检测显示敲低TRIM28抑制im BMSC凋亡。(4)敲低TRIM28促进im BMSC逆转肝纤维化用四氯化碳诱导法构建小鼠肝纤维化模型,尾静脉输注1×10^6个细胞检测im BMSC逆转肝纤维化能力以及TRIM28对im BMSC逆转肝纤维化的影响。结果表明:构建的永生化小鼠骨髓间充质干细胞系具备逆转肝纤维化能力,敲低TRIM28能够促进永生化小鼠骨髓间充质干细胞逆转肝纤维化。综上所述,本研究发现敲低TRIM28能够显著抑制im BMSC凋亡,以及促进im BMSC逆转四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化。本研究构建的im BMSC细胞系,可用作于细胞治疗和组织工程的种子干细胞,为基础和临床研究提供便利。