2，4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU及其工程菌催化吲哚转化靛蓝的研究

作     者：刘荣荣 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于大海

授予年度：2023年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 08[工学] 

主      题：2,4-二氯苯酚羟化酶 分子对接 分子动力学模拟 吲哚 全细胞催化 靛蓝 

摘      要：2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU作为一种新颖的羟化酶,具有较广的芳香族化合物底物谱,对多种氯酚类和联苯类底物均有一定的催化活性。课题组前期通过对TfdB-JLU底物非专一性(substrate promiscuity)与蛋白结构之间关系的研究,利用半理性设计对其催化氯酚类和联苯类底物的非专一性实现了调控。近期研究发现,TfdB-JLU还可以催化多种吲哚类杂环芳香化合物,但目前尚不清楚其催化机制,具有实际应用价值的吲哚生物催化转化体系也鲜有报道。本研究一方面通过对TfdB-JLU的结构及其与吲哚之间的相互作用分析,选择可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性中心的氨基酸作为突变位点,通过对野生型及其突变体进行表达、纯化、酶活检测,结合分子动力学模拟研究,对TfdB-JLU催化吲哚的机制进行了初步探究;另一方面考虑到酶促吲哚生物转化过程中酶纯化过程繁琐、耗损率高和需要额外添加昂贵的辅酶等因素,本研究探讨了以TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化路径,并对转化条件进行了优化,为探索TfdB-JLU催化吲哚生物转化的实际应用提供了可能性。本研究的主要内容和研究结果如下:(1)2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU催化吲哚的研究以2-羟基联苯-3-单加氧酶(PDB ID:5BRT)的晶体结构为模板进行同源模建得到TfdB-JLU的结构,利用Auto Dock 4.2与吲哚进行分子对接;基于分子对接结果选择了His47、Met251、Pro316这三个可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性口袋的位点进行单点和组合突变,对TfdB-JLU的野生型和突变体进行表达、纯化和酶活检测,发现与野生型相比,突变体M251G和P316G提高了对吲哚的催化活性,而突变体H47A、M251G/P316G则基本丧失了对吲哚的催化活性。通过分子对接结果推测,突变体P316G催化吲哚活性提高的原因可能是酶与吲哚之间的价键作用增加,提高了与吲哚的亲和力;突变体M251G催化吲哚活性提高的原因可能是突变后酶活性口袋的入口变大,更有利于底物的进入;突变体H47A催化吲哚活性基本丧失,说明47位的组氨酸可能是TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一。通过对野生型和突变体的分子动力学模拟研究推测组合突变体M251G/P316G催化吲哚活性大幅降低的原因可能是突变对活性口袋附近的结构柔性改变太大导致酶的稳定性降低。(2)TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的研究本研究建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,并对转化条件进行了优化,以提高吲哚转化靛蓝的效率。结果表明TfdB-JLU工程菌的全细胞催化能够将吲哚转化为靛蓝,靛蓝的起始产率为11.9%;对转化条件进行优化后的最适条件为:培养基为M9培养基,诱导时间为8 h,吲哚浓度为2.5 m M,反应温度为25℃,反应时间为16 h,反应p H为9,在此条件下TfdBJLU工程菌催化吲哚转化靛蓝的产率达到35.7%。综上所述,本研究运用蛋白质工程和生物信息学手段对TfdB-JLU催化吲哚进行了初步研究,发现酶局部结构变化会对TfdB-JLU与吲哚的结合方式、结合能力和酶的稳定性产生影响,进而影响其催化吲哚的能力,同时发现47位的组氨酸可能是影响TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一,为TfdB-JLU催化吲哚机制的解析奠定了一定基础;本研究也建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,将对吲哚类废水的处理和资源化转化具有重要意义。