红花CtCYP71A1基因的克隆及调控木质素生物合成的研究
作者单位：吉林农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘秀明
授予年度：2023年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 10[医学]
主 题：红花 木质素 CtCYP71A1基因 干旱胁迫
摘 要：红花是我国传统的中草药,有一定的药用价值和经济价值,广泛种植于新疆、四川等地,具有一定的耐旱性,目前,对其耐旱机制的研究还较少。细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450s)是高等植物中最大的酶蛋白家族,在植物的基础代谢和次生代谢过程中均扮演着非常重要的角色,其催化的反应类型广泛且复杂,而红花中的CtCYP71A家族基因功能尚未被解析。本研究根据红花基因组测序数据对CtCYP71A亚家族基因进行生物信息学分析,对筛选到的16条CtCYP71A亚家族基因进行系统发育分析,并对该亚家族基因的保守基序、基因结构及顺式作用元件进行预测,利用RNA测序(RNA-seq)及荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对红花不同组织的表达模式进行分析,克隆红花CtCYP71A亚家族成员CtCYP71A1,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位分析,分析不同处理下CYP71A1基因的表达模式变化,利用转基因拟南芥和瞬时转化的红花进行功能鉴定,初步探究CtCYP71A1在木质素合成及干旱胁迫中的功能。主要取得以下研究成果:1.基于红花基因组数据库筛选得到16个红花CtCYP71A基因,系统进化分析表明CtCYP71A家族基因与拟南芥的A型CYP71家族聚在同一个分支上,氨基酸结构及基因结构分析表明亚家族成员间具有较高的结构保守性,启动子分析显示该家族基因具有干旱、茉莉酸甲酯(MEJA)、水杨酸(SA)和赤霉素(GA3)等响应元件,RNA-seq数据及qRT-PCR结果表明CtCYP71A亚家族基因具有组织表达特异性。结合生物信息学及不同组织表达分析结果,挖掘到红花CtCYP71A亚家族在根组织中存在特异性表达的基因CtCYP71A1。2.从红花根中克隆CtCYP71A1基因,编码区序列为1287 bp。对CtCYP71A1蛋白进行二级结构、三级结构预测,发现α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链所占比例分别为46.96%、6.54%、31.78%和14.72%,三级结构的GMQE值为0.67,表明其蛋白结构较为稳定。不同物种CYP71A1氨基酸序列比对表明,CtCYP71A1蛋白序列也包含典型的P450蛋白保守结构域且与其他物种具有较高同源性。3.构建了CtCYP71A1::GFP融合蛋白植物表达载体p CAMBIA1300-CtCYP71A1,在本氏烟草叶片中进行瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜检测荧光信号,结果表明CtCYP71A1蛋白定位于细胞膜和细胞核上。对野生型红花进行四种非生物胁迫处理,结果发现CtCYP71A1基因在聚乙二醇(PEG6000)胁迫诱导48 h时表达量最高,脱落酸(ABA)胁迫诱导12 h时表达量达到最高,随后开始降低,GA3胁迫诱导24 h时、SA胁迫诱导3 h时表达量达到最大值,随即降低,表明CtCYP71A1对红花干旱胁迫响应最明显。4.通过花序侵染法获得高表达拟南芥株系OE-3和OE-6,与野生型(WT)及突变体(Mut)相比,转CtCYP71A1基因拟南芥中的木质素含量显著提高2倍,其合成途径中关键酶基因(PAL、4CL、HCT、CCR、CAD)被显著上调,突变体则与之相反。培养基中进行PEG模拟干旱的结果表明,10%PEG处理时表型最明显,转基因株系的根长明显比野生型长,突变体则与之相反,对其根系进行二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)化学组织染色,发现突变体株系的过氧化氢(HO)和超氧阴离子(O)积累较多,转基因株系中HO和O的含量较少。土壤干旱胁迫的结果表明,处理15天后转基因株系生长状态和鲜重同样也明显优于其突变体和野生型材料,且植物根系中的木质素含量较对照组提高了0.5倍,丙二醛(MDA)、O和HO含量显著较突变体和野生型显著降低,脯氨酸(Pro)含量显著增加。5.利用基因沉默(VIGS)技术对红花发芽期植株进行了真空泵侵染,将CtCYP71A1基因连接到烟草脆裂病毒(Tobaccorattle virus,TRV)载体中,通过qRT-PCR分析红花CtCYP71A1基因的表达情况,成功获得3株沉默CtCYP71A1基因的红花植株。对其进行土壤干旱20 d后,进行表型及生理指标检测,与注射空载植株相比,pTRV2-CtCYP71A1株系的长势较弱,且鲜重和木质素含量较低,MDA、O和HO含量显著提高,脯氨酸含量显著降低,初步说明CtCYP71A1基因促进红花根部木质素积累。
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