提高CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑效率小分子的筛选与验证

作     者：李鑫禹 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：牟彦双;陈思

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：CRISPR 精确基因编辑 小分子 猪PK15细胞 

摘      要：CRISPR/Cas9能特异性的切断DNA双链,在DNA修复过程中小分子化合物能通过抑制非同源末端链接(Non-homologous end joining,NHEJ)或增强同源重组修复(Homology directed repair,HDR)来提高CRISPR/Cas9精准基因编辑效率。前期的研究表明,小分子化合物提高CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑效率具有物种特异性和细胞特异性特点。本研究主要对在猪中能提高CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑的小分子化合物进行了筛选和功能验证。1)实验选定8种小分子化合物:AZD7762、SCR7、VE-822、Brefeldin A、RS-1、NU7441、L-189、L755507。其中,L-189、SCR7、NU7441是抑制DNA修复过程种非同源末端重组,RS-1、Brefeldin A、L755507、VE-822、AZD7762是增强DNA修复过程中同源重组修复。本研究通过小分子对细胞毒性的作用筛选出添加的最适浓度,结果表明,体外培养猪PK15细胞小分子的最适浓度分别为:Brefeldin A为0.5μM;SCR7为10μM;L-189为5μM;AZD7762为2μM;VE-822为2μM;NU7441为1μM;L755507为5μM;RS-1为10μM。2)在CRISPR/Cas9系统与硫代修饰的单链DNA模板介导的精准基因编辑系统基础上,通过分别添加8种不同的小分子来筛选和验证在猪上提高精准基因编辑效率的小分子,结果表明,与对照组相比L755507使得精准基因编辑效率提高1.91倍,SCR7使得精准基因编辑效率提高1.89倍,RS-1使得精准基因编辑效率提高2.10倍,L-189使得精准基因编辑效率提高1.71倍,NU7441使得精准基因编辑效率提高2.28倍,Brefeldin A使得精准基因编辑效率提高1.87倍,AZD762使得精准基因编辑效率提高1.43倍,VE-822使得精准基因编辑效率提高1.46倍。3)在CRISPR/Cas9系统与硫代修饰的单链DNA模板介导的精准基因编辑系统基础上,通过增强同源修复的小分子与抑制非同源末端修复的小分子组合,筛选出对精准基因编辑效率有进一步提高的小分子组合,结果表明,与对照组相比SCR7+L755507小分子组合提高精准基因编辑效率1.90倍,SCR7+RS-1组合提高精准基因编辑效率1.99倍,SCR7+Brefeldin A组合提高精准基因编辑效率1.87倍,L-189+L755507组合提高精准基因编辑效率1.81倍,L-189+RS-1组合提高精准基因编辑效率1.89倍,L-189+Brefeldin A组合提高精准基因编辑效率1.79倍,NU7441+L755507组合提高精准基因编辑效率1.98倍,NU7441+RS-1组合提高精准基因编辑效率2.11倍,NU7441+Brefeldin A组合提高精准基因编辑效率2.03倍。本研究对在猪中提高CRISPR介导得精准基因编辑效率小分子进行了筛选与验证,为猪高效精准基因编辑体系建立提供方法支持。