两种新型酶联免疫吸附法检测赭曲霉毒素A和金黄色葡萄球菌肠毒素A

作     者：熊汉鹏 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：熊勇华;冷远逵

授予年度：2023年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 100403[医学-营养与食品卫生学] 10[医学] 

主      题：等离子共振ELISA 荧光ELISA ssDNA 金生长 MPA-QDs 双功能噬菌体 

摘      要：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A,SEA)是两种最常见的生物毒素。酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)因具有操作简单、成本低廉、特异性好及高通量等优势,是快速筛查检测OTA和SEA最常用的方法之一。然而,基于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化氧化四甲基联苯胺(TMB)作为信号输出的ELISA方法存在比色信号色度变化单一,信号强度偏弱等缺陷,导致检测灵敏度偏低,且无法实现现场裸眼检测;其次,构建检测真菌毒素的ELISA方法,在合成竞争抗原的过程中需要利用有毒的真菌毒素以及大量的有机试剂,易对环境和相关从业人员身体健康造成威胁。基于AuNPs聚集、生长的pELISA方法具有更高的检测灵敏度,且检测结果适合于裸眼判读,但同时存在信号输出体系稳定性差的缺陷。通过ssDNA数量来调控AuNPs生长形貌作为pELISA的输出信号,克服了常规pELISA方法信号输出体系稳定性差的缺陷。但DNA的构型是如何调控AuNPs形貌,进而影响pELISA信号输出的灵敏度,到目前为止未见详细报道。为此,本研究设计了6种不同DNA序列,详细探讨了DNA构型对pELISA检测灵敏度的影响,最后发现以具有发夹结构的ssDNA调控AuNPs的生长,pELISA检测灵敏度最高。在此基础上,进一步以p3区域融合表达了OTA模拟表位肽、p8区域大量修饰生物素的双功能M13噬菌体(Biotin-M13)为竞争抗原以及过氧化氢酶(CAT)的“集装箱,构建了一种对环境友好,可裸眼高灵敏检测OTA的pELISA新方法。在该检测体系中,Biotin-M13通过结合大量的CAT放大酶催化效果,CAT通过水解HO来调控芬顿反应产羟自由基,进而调控ssDNA数量,而ssDNA数量又可进一步调控AuNPs生长过程中的形貌变化。在最佳优化条件下,该方法裸眼定性检测OTA的检测限为20 pg/mL,仪器定量检测OTA的线性范围为1～200 pg/mL,线性方程可表述为y=17.063 ln(x)+118.56(R=0.9907),检测OTA的最低检测限为1.58 pg/mL,灵敏度较常规HRP-ELISA提高97倍。玉米样本加标回收实验显示批内、批间的回收率介于85%～110%之间,变异系数小于15%,表明本实验构建的pELISA方法具有较好的准确性以及精密度。其次,利用巯基丙酸修饰的CdTe量子点(MPA-QDs)对HO和p H极度敏感的特点,构建了一种检测乳制品中SEA的超灵敏荧光酶联免疫吸附(FELISA)方法。该方法以MPA-QDs为荧光信号输出材料,以葡萄糖氧化酶(GOx)为酶标记物,当检测体系存在SEA时,GOx催化氧化葡萄糖产酸和HO,MPA-QDs的荧光发生猝灭。在最优条件下,该方法检测脱脂液态奶以及全脂液态奶中SEA的最低检测限为6.65 pg/mL和3.4 pg/mL,检测乳粉中SEA的检测限为0.29 ng/g,该灵敏度较常规HRP-ELISA高678倍。牛奶加标回收实验结果显示,本研究构建的FELISA方法批内和批间的加标回收率分别为在92.65%～109.73%和86.35%～101.75%之间,变异系数均小于15%,表明该pELISA方法具有较高的准确性以及精密度;进一步将检测结果与传统HRP-ELISA方法比较,结果表明两种方法检测结果具有高度一致性。但本研究构建的pELISA方法具有更高的检测灵敏度,因此可用于溶液中痕量SEA检测,同时也可用于复杂食品基质中SEA的检测。