红花CtCP1基因克隆及其在叶片衰老中的作用

作     者：吕彦羲 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚娜

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 10[医学] 

主      题：红花 CtCP1 木瓜类半胱氨酸蛋白酶 叶片衰老 

摘      要：红花是我国传统的一种经济作物,可以食用、药用、油用,开发潜力极大。叶片衰老是发育过程中的正常现象,但在红花种植中,叶片早衰会造成品质下降,直接导致经济损失。目前为止,关于红花早衰过程的分子机制还不明确。木瓜类半胱氨酸蛋白酶(CP)广泛参与植物生长发育过程,常被报道与植物衰老相关。越来越多的植物中鉴定出了CP全基因组序列,但在红花中还未见报道。本研究根据红花基因组测序数据对红花CP家族进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术分析了红花不同组织的表达量,从中筛选出与叶片衰老呈正相关的CtCP1基因;构建大肠杆菌原核表达载体,分析对常见底物酶活的差异;构建植物表达载体,获得T3代高表达拟南芥及瞬时转化红花株系,进行低温及水杨酸胁迫,进而鉴定CtCP1基因在叶片衰老过程中的功能。具体研究结果如下:1.通过生物信息学从红花中鉴定出25个CtCP候选基因,命名为CtCP1-CtCP25,根据系统发育分析,将其分为7个亚类(CEP、XCP、XBCP3、THI、SAG12、ALP和CTB)。基因结构分析表明不同亚家族成员间结构保守性较低,但同一个亚家族成员具有较高的保守性;启动子分析结果显示,CtCP家族基因启动子存在ABRE脱落酸响应、TCA-element水杨酸响应、GT1-motif、G-box光响应元件、LTR低温胁迫、ARE抗氧化胁迫、TC-rich repeats防卫反应、种子特异性调控以及胚乳表达等作用元件。2.利用荧光定量PCR方法对候选基因进行表达分析,结果表明不同亚家族基因在不同组织上的表达存在差异,在叶片组织中CtCP1表达量最高,在根和花组织中CtCP3表达量最高,在茎组织中CtCP6表达量最高。其中,CtCP1基因表达量在叶片衰老初期到晚期表达量呈现由低到高趋势,与叶片底部到顶端表达量趋势一致。3.成功克隆出CtCP1基因编码区序列1096 bp。通过大肠杆菌原核表达了重组p ET32a-CtCP1蛋白,大小为62.03 kDa。并证实CtCP1蛋白对传统的蛋白酶底物活性有所差异。4.通过花絮侵染法获得转基因拟南芥,在T3代转基因材料中鉴定两株高表达株系。在野生型株系、高表达株系和突变体株系上进行水杨酸和低温两种非生物的胁迫,结果分析表明:通过100 mmol/L水杨酸或低温处理后,CtCP1基因的表达量在高表达拟南芥中显著上调,衰老密切相关指标(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶表达量以及丙二醛含量)呈正相关,抗氧化密切相关指标(过氧化物酶表达量以及叶绿素、可溶性糖、脯氨酸含量)则显著降低,死细胞增多。突变体与之相反,野生型株系处于两者之间。通过三种拟南芥株系变化,推测出CtCP1基因对叶片衰老起促进作用,且在水杨酸和低温胁迫下呈现出更高的敏感性。5.构建红花叶片瞬时转化体系,利用超表达和基因沉默技术(VIGS),随后在水杨酸和低温胁迫下,观察表型变化。结果显示:CtCP1基因在瞬时过表达中显著上调,与衰老相关基因CtSAG12、CtSAG29及叶绿素相关基因CtNYC1呈正相关,且叶绿素含量降低,超氧阴离子和死细胞增多。沉默株系与之相反。整体结果与拟南芥相似,再次印证CtCP1基因对植物衰老起促进作用。