基于酶分子半理性设计的多酶催化合成二元羧酸体系的构建

作     者：陆洁 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：聂开立

授予年度：2023年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：癸二酸 仲醇脱氢酶 Baeyer-Villiger单加氧酶 多酶级联反应 半理性设计 分子模拟 

摘      要：以癸二酸为代表的α,ω-二元羧酸(α,ω-DCAs)是重要的化学工业中间体,在食品医药、农业生产,尤其是高分子材料生产领域具有广泛的应用。传统的以化学氧化裂解/热解为基础的癸二酸生产工艺涉及强酸强碱、有毒有害溶剂,存在能耗高、污染严重,过程副产物不可控等缺陷。生物催化技术的发展为癸二酸的绿色可持续生产提供了新的机遇。然而癸二酸生产的多酶级联反应体系中存在许多限制性因素,包括(1)Baeyer-Villiger单加氧酶与仲醇脱氢酶的辅因子特异性不匹配,辅因子无法自循环再生;(2)天然的可用于癸二酸生物催化合成的Baeyer-Villiger单加氧酶来源稀少,常存在稳定性差、催化活性低等不足;(3)体系中各酶的最适反应条件不同,多酶体系的工艺参数亟待优化。本课题旨在解决上述限制性问题,开发并优化高效、专一、绿色的癸二酸多酶级联催化合成体系。首先,基于分子模拟技术,通过定向进化和半理性设计将来自Micrococcus luteus WIUJH20的仲醇脱氢酶(Ml ADH)的辅因子特异性从NAD改造为NADP,筛选得到的Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)以NADP为辅因子进行催化时癸二酸产率提高了3.7倍。同时,在Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)和来自Pseudomonas aeruginosa的Baeyer-Villiger单加氧酶(Pa BVMO)之间成功构建了NADP/NADPH原位再生自循环系统,使多酶催化体系的癸二酸最终产率提高至49.3%,简化了产物分离难度,降低了酶促转化过程的成本。其次,基于过氧化氢通道预测和定点突变提升Pa BVMO氧化稳定性,Pa BVMO单突变体(Y404L)的癸二酸催化转化率相比野生型提高了37%;基于B因子计算和定向饱和突变提升Pa BVMO热稳定性,Pa BVMO单突变体R354P和R354F的癸二酸催化转化率相比野生型分别提高了50%和41%;在此基础上通过迭代突变,Pa BVMO双突变体(R354P-Y404L)的癸二酸催化转化率相比提高了51%。最终,对多酶级联体系催化工艺参数进行优化。当Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)和Pa BVMO突变体(R354P-Y404L)的最适耦合催化比例为1:6,此时癸二酸最终产率达到78.34%。结合单因素优化和响应面分析,最佳工艺参数条件为p H 8.8、反应温度26.5℃,Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)及Pa BVMO突变体(R354P-Y404L)添加配比为1:6.5,此时癸二酸最终产率达到87.73%,与添加GDH和NOX辅助辅因子再生系统的多酶共催化体系相比提高了2.38倍。本课题基于酶分子的半理性设计,构建了癸二酸多酶催化合成体系内的辅因子再生自循环系统;进化提高了系统关键酶蛋白的催化稳定性;并完成了多酶偶联催化工艺参数的优化,有效提高了多酶催化体系的催化效率和癸二酸产率。该高效、绿色的癸二酸多酶催化合成体系,为天然脂肪酸生产癸二酸提供了新的途径,为油脂资源的生物炼制提供了新的技术支撑。